新的乙型肝炎病毒X基因突變體的發(fā)現(xiàn)及其功能研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的持續(xù)感染與慢性肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關。乙肝病毒X開放讀碼框編碼的X蛋白（HBx）在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，但其致癌的分子機制目前尚不十分清楚。為了進一步闡明HBx與肝癌發(fā)病的關系，我們檢測了慢性肝病患者血清中乙肝病毒X抗原（HBxAg）和抗HBx抗體（anti-HBx）；應用PCR技術對慢性肝病患者血清中乙肝病毒X基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)了新的HBV x基因突變體，在此基礎上

2、對新的HBV X基因突變體的功能進行了研究。主要研究內容如下：
　　 第一部分，兔抗人HBx蛋白多克隆抗體的制備
　　 為了闡明慢性肝病患者血清中HBxAg和anti-HBx的臨床意義，制備了兔抗人HBx蛋白多克隆抗體。實驗中，首先應用PCR技術，獲得HBx基因片斷，然后將其克隆至pET-30a原核表達載體中，將其命名為pET-30a-X。將pET-30a-X質粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，經異丙基-β-D-硫代

3、半乳糖苷（IPTG）誘導，大量表達His-HBx融合蛋白；利用Ni-NTA磁珠對His-HBx融合蛋白進行純化；純化后將重組蛋白免疫家兔，制備兔抗HBx多克隆抗體，并對該抗體進行純化。
　　 第二部分，慢性肝病患者血清中HBxAg和anti-HBx的測定及其臨床意義
　　 為了闡明慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者血清中HBxAg和anti-HBx的臨床意義，我們應用純化的兔抗HBx多克隆抗體和重組蛋白，建立酶聯(lián)免疫吸附實驗

4、（ELISA）技術，分別對173例慢性乙型肝炎（CHB）、106例肝硬化（LC）和61例肝癌（HCC）患者及213例正常人血清中的HBxAg和anti-HBx進行了檢測。結果顯示，HBxAg/anti-HBx在CHB、LC和HCC患者血清中的陽性率分別為8.7％/10.4％、17.9％/14.6％和9.8％/34.4％。統(tǒng)計學分析結果顯示，與CHB組相比，LC或HCC患者血清中anti-HBx的陽性率較高（P<0.01）。結合臨床病歷中

5、記錄的其他HBV血清學指標檢測結果，進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在血清anti-HBs陽性病例中，anti-HBx的陽性檢出率為5.2％（1/19）；而在HBsAg、HBeAg和anti-HBc三項同時為陽性的病例中，anti-HBx的陽性檢出率為28.9％（39/135），二者相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。對照組213名正常人血清中HBxAg和anti-HBx均為陰性。本研究結果提示，血清中anti-HBx并非一個保護性抗體，而是H

6、BV感染和復制的標志，是從CHB向LC或HCC發(fā)展的重要標志之一。
　　 第三部分，新的乙肝病毒x基因突變體的發(fā)現(xiàn)
　　 HBV感染后患者血清中病毒DNA發(fā)生突變與HBV的致病作用密切相關。實驗中，我們應用PCR方法對42例CHB、94例LC和52例HCC患者血清中HBx基因進行擴增，對PCR產物進行序列測定，檢測HBx基因的突變情況。結果顯示，在1例CHB和2例LC患者血清中檢測出一個未見報道的新的HBx基因突變位點。

7、3例位點均在HBx基因的第382-401個堿基發(fā)生了缺失突變，導致新的終止密碼子TAG產生，致使X蛋白從第127個氨基酸起羧基末端表達缺失。
　　 第四部分：突變型HBx蛋白功能變化的研究
　　 為了進一步詳細闡明該HBx基因突變體發(fā)生的分子病毒學意義，我們將來源于血清中發(fā)生突變的HBx基因構建于真核表達載體pCDNA3中，命名為pCDNA3-X-Sera。此外，人為將野生型HBx基因的C末端編碼27個氨基酸的81個堿基

8、進行缺失突變，將其克隆在真核表達載體pCDNA3中，命名為pCDNA3-X△127。為進一步研究該突變體的功能變化奠定基礎。從以下幾個方面進行了研究：
　　 第一，誘導細胞凋亡的作用：將pCDNA3-X-Sera、pCDNA3-X△127質粒和克隆有野生型HBx基因的真核表達載體（pCMV-X）分別進行瞬時基因轉染，導入人正常人L-O2肝細胞系中，通過流式細胞術分析。結果顯示，野生型HBx基因具有促細胞凋亡的作用，而兩個突變型H

9、Bx基因的上述功能消失。
　　 第二，介導細胞轉化的作用：實驗中，應用基因轉染技術將pCMV-X質粒和克隆有3’端缺失突變型HBx基因的pCDNA3-X-Sera、pCDNA3-X△127質粒分別導入培養(yǎng)的人正常肝細胞系L-O2中，經G-418篩選，獲得了穩(wěn)定表達HBx蛋白的肝細胞系，分別命名為L-O2-X、L-O2-X-Sera和L-O2-X△127。然后，對L-O2-X、L-O2-X-Sera和L-O2-X△127細胞進行了

10、生物學特性鑒定，從細胞形態(tài)、染色體核型、細胞動力學、細胞周期、克隆形成率和癌蛋白表達等方面進行檢測。結果顯示，與L-O2-X細胞相比，L-O2-X-Sera和L-O2-X△127細胞在染色體核型分析方面，表現(xiàn)出更為明顯的染色體丟失或異倍體；在細胞增殖方面，增殖能力明顯增強；在克隆形成率方面，具有較高的能力：c-Myc、PCNA和cyclinD1的表達水平明顯增加。初步結果提示，新發(fā)現(xiàn)的HBx基因突變體具有更強的細胞轉化能力。
　　

11、 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血清中anti-HBx是慢性肝病患者從CHB向LC和（或）HCC發(fā)展的重要血清學標志之一；從慢性肝病患者血清中發(fā)現(xiàn)了新的HBx基因突變體，導致HBx蛋白羧基末端的27個氨基酸表達缺失；與野生型HBx基因相比，該HBx基因突變體的促細胞凋亡功能消失，但其細胞轉化能力明顯增強，對發(fā)揮其致癌作用具有重要意義。上述研究為揭示HBx基因和HBx蛋白致癌的分子機制提供了新的重要的實驗依據(jù)，對肝癌的早期診斷、預防和治療具有重要