乙型肝炎治療耐藥基因突變的焦磷酸測序診斷技術(shù)研究.pdf

1、目前檢測乙肝病毒耐藥突變的方法主要有直接測序法、線性探針分析法、限制性片段長度多態(tài)性分析及基因芯片等技術(shù)。上述方法都是基于PCR基礎(chǔ)上的操作，且只有YMDD耐藥突變的實時熒光定量PCR檢測技術(shù)應(yīng)用于臨床進(jìn)行定性檢測，尚無比較全面和滿意的針對多種耐藥基因突變定性和定量檢測變異株的方法。
　　焦磷酸測序技術(shù)具有準(zhǔn)確率高，靈活性大，重復(fù)性強(qiáng)，操作簡單等優(yōu)勢，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多個研究領(lǐng)域，尤在SNP分析方面有較大的技術(shù)優(yōu)勢。借助焦磷酸測序技

2、術(shù)的發(fā)展，建立焦磷酸測序技術(shù)檢測拉米夫定和阿德福韋酯治療乙肝所致乙肝病毒基因耐藥突變的定量檢測方法，為臨床乙肝耐藥診斷和治療提供依據(jù)。
　　針對乙肝病毒DNA聚合酶基因序列上4個常見基因突變位點的6種突變形式，分別克隆構(gòu)建野生型和突變型質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用生物信息學(xué)手段設(shè)計目標(biāo)基因通用PCR引物和各突變點的焦磷酸測序引物，建立焦磷酸測序的突變檢測方法。對接受拉米夫定、阿德福韋酯治療的慢性乙型肝炎患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測。
　　構(gòu)

3、建了乙肝病毒四種常見耐藥性突變的標(biāo)準(zhǔn)株和變異株克隆，建立了分別或同時檢測拉米夫定、阿德福韋酯耐藥突變的焦磷酸測序方法，對72例臨床耐藥或疑似耐藥的患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，雙脫氧測序驗證，檢出拉米夫定耐藥突變32例，阿德福韋酯耐藥突變5例，其中焦磷酸測序檢出20例為混合突變，而雙脫氧測序顯示為6例。
　　結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析，拉米夫定治療組耐藥突變率與LokAS的研究結(jié)果一致，數(shù)據(jù)顯示拉米夫定治療組耐藥發(fā)生率較高，一年期耐藥發(fā)生率為2