乙型肝炎病毒多聚酶區(qū)基因突變的監(jiān)測與突變對病毒復(fù)制力影響的分析.pdf

1、研究背景：核苷（酸）類似物（nucleos（t）ide analogues，NA）的問世及其在臨床中的應(yīng)用，對于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染患者來說具有革命性的意義?？梢远唐趦?nèi)迅速抑制HBV復(fù)制，減輕肝臟炎癥，延緩病情發(fā)展。由于HBV多聚酶（polymerase）缺乏嚴(yán)格的校正機(jī)制，在長期使用核苷（酸）類似物過程中耐藥病毒株的出現(xiàn)似乎是不可避免的。耐藥可以導(dǎo)致治療失敗和病情進(jìn)展，是臨床工作中一個棘手

2、的問題。耐藥突變株的選擇是動態(tài)過程，從可檢測到基因型耐藥（genotypic resistance）到發(fā)生表型耐藥（phenotypic resistance）（如病毒學(xué)突變及其后的生化學(xué)突變）的時間很大程度上依賴于突變病毒株的復(fù)制能力，因此對于耐藥突變株的檢測以及分析其復(fù)制能力可以幫助臨床醫(yī)生監(jiān)測病毒耐藥，根據(jù)患者不同的病毒學(xué)特征制定、優(yōu)化抗病毒治療，達(dá)到個體化治療的目的。
　　 目的：監(jiān)測基因型耐藥以輔助臨床制定最合理的抗病

3、毒治療方案；分析新出現(xiàn)的突變對于HBV復(fù)制力的影響；為建立適用于臨床的簡便快速準(zhǔn)確的表型分析提供方法學(xué)支持。
　　 方法：首先對6000例慢性HBV感染患者進(jìn)行耐藥突變檢測，對5例慢性乙型肝炎患者進(jìn)行最短50周的隨訪，對1例患者進(jìn)行了回顧性研究，監(jiān)測HBV DNA和肝功能的動態(tài)變化；其次從6例慢性乙型肝炎患者血清中獲得HBV全長基因組克隆11個，使用定點突變技術(shù)在特定位點引入突變得到19個克隆；接下來建立了高敏感性和特異性的實時

4、PCR法，用于檢測突變株的病毒復(fù)制力；最后使用無載體介導(dǎo)系統(tǒng)將30個克隆的HBV全長基因組轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞系，使用實時PCR法評估病毒復(fù)制力，同時使用Southern免疫印跡法分析來源于＃624患者的突變株的復(fù)制力以驗證實時PCR的結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 （1）根據(jù)基因型耐藥檢測結(jié)果，臨床醫(yī)生及時調(diào)整抗病毒治療方案，延遲或避免耐藥的發(fā)生，提高了療效；
　　 （2）我們建立的實時PCR具有高敏感性和可控制的

5、變異性，最低檢測下限為200 IU/mL，檢測范圍是6 Loglo單位；
　　 （3）相對于野生型HBV而言，rtL217P可以增加復(fù)制力1.98倍，rtM204I+rtL217P增加復(fù)制力1.20倍。其它突變不同程度地降低HBV的復(fù)制力。HBsAg的分泌水平的變化也基本一致。Southern免疫印跡法檢測結(jié)果與實時PCR結(jié)果一致：
　　 （4）在受檢6000例患者中，共有394例（6.57％）存在rt229突變，與LA

6、M治療相關(guān)的占78.93％，最常見的突變形式是rtL229V+LAM。復(fù)制力評價結(jié)果顯示rt229位點的突變可降低HBV的復(fù)制力，部分恢復(fù)LAM耐藥病毒株的復(fù)制力。
　　 結(jié)論：
　　 （1）建議在基線及抗病毒過程中進(jìn)行耐藥突變監(jiān)測，從而可以及早的對治療進(jìn)行干預(yù)，提高療效；
　　 （2）rtL217P明顯增強(qiáng)HBV的復(fù)制力，rt229突變明顯抑制HBV的復(fù)制力，但二者均可以恢復(fù)LAM突變株的復(fù)制力，推測可能是LA