La蛋白及其突變對(duì)乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄翻譯啟動(dòng)和復(fù)制的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染的治療藥物研究雖然已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但如何完全阻斷HBV在體內(nèi)的復(fù)制一直是生物醫(yī)學(xué)面臨的重大挑戰(zhàn)。抗HBV藥物已成為當(dāng)今全球抗病毒藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。新近研究發(fā)現(xiàn)，La蛋白(La)具有穩(wěn)定HBVRNA，使其免受核酸酶破壞的作用，引起相關(guān)學(xué)者的高度關(guān)注。La與HBV之間的相互作用研究有許多亟待解決的問(wèn)題，相關(guān)機(jī)制的深入探索將為抗HBV藥物研發(fā)提供新的靶點(diǎn)和途徑。 本課題分別在體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)和穩(wěn)定表達(dá)HB

2、V肝癌細(xì)胞中，擬通過(guò)研究La及突變體對(duì)adr亞型HBVRNA的結(jié)合親和力分析、HBV及ORF體外轉(zhuǎn)錄翻譯的影響，以及細(xì)胞內(nèi)La與HBV復(fù)制的關(guān)系，探討La及其突變對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄、翻譯啟動(dòng)、HBVRNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)表達(dá)和病毒復(fù)制的影響，并期望通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)影響HBV復(fù)制的關(guān)鍵因素，尋找阻斷HBV復(fù)制的新的干預(yù)方法，為乙型肝炎病毒的防治提供新的策略。研究分為以下三個(gè)部分進(jìn)行。 第一部分人La蛋白及其突變體原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和誘導(dǎo)表

3、達(dá)純化 本實(shí)驗(yàn)采用定點(diǎn)突變和PCR技術(shù)，完成點(diǎn)突變和大片段缺失突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，獲得hLa三個(gè)突變體DeL1，DeL2，DeL3真核表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中融合表達(dá)，經(jīng)親和層析和HPLC純化，實(shí)現(xiàn)了野生型hLa及其突變體的誘導(dǎo)表達(dá)和純化，為后期實(shí)驗(yàn)研究打下了關(guān)鍵基礎(chǔ)。 1.突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建野生型hLa表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，利用PfuUltraHigh-fidelityDNApolymerase完成點(diǎn)突變；合理設(shè)計(jì)

4、引物，利用PCR技術(shù)，進(jìn)行片段缺失突變。測(cè)序結(jié)果表明，hLa突變體表達(dá)質(zhì)粒的序列正確，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。2.野生型hLa及其突變體表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將經(jīng)測(cè)序分析正確的野生型hLa和突變體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta2，分別誘導(dǎo)表達(dá)，篩選出表達(dá)量高的菌種。以50mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4，0.5mol/LNaClpH8.0(1g菌體/20mL)懸浮菌體，超聲破碎，收集上清液。經(jīng)His親和柱

5、層析純化后的樣品調(diào)整pH為5.5，進(jìn)行離子交換層析純化，以20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4pH5.5的緩沖液對(duì)其進(jìn)行脫鹽，更換緩沖體系，HPLC進(jìn)一步純化，收集洗脫峰。蛋白濃度分別為hLa(0.8mg/mL)、DeL1(0.7mg/mL)、DeL2(0.6mg/mL)、DeL3(0.5mg/mL)。 第二部分體外系統(tǒng)中hLa及其突變體對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響 HBV的DNA、RNA等調(diào)節(jié)基因區(qū)都有肝細(xì)胞

6、蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。肝細(xì)胞蛋白與這些調(diào)節(jié)基因之間的結(jié)合，調(diào)節(jié)HBV的轉(zhuǎn)錄與基因表達(dá)。hLa作為肝臟核提取物的成分之一，對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用尚無(wú)明確定位。本部分研究采用電泳遷移率變動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)和體外轉(zhuǎn)錄翻譯體系，研究hLa及其突變體對(duì)HBVRNA的遷移率、HBV及ORF體外轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響。 1.hLa及其突變體與HBVRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合性分析根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬分析預(yù)測(cè)的結(jié)果，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得HBV莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA，采用EMSA比較hL

7、a及突變體與HBVRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的電泳遷移率，分析hLa的位點(diǎn)突變對(duì)結(jié)合HBVRNA產(chǎn)生的影響。EMSA的結(jié)果表明，野生型hLa與HBVRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的親和力最高；DeL1和DeL3的結(jié)合力下降；DeL2幾乎無(wú)結(jié)合能力。提示，hLa的位點(diǎn)突變不同程度的影響了其與HBVRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的親和力，影響的程度與突變位點(diǎn)密切相關(guān)。 2.hLa及其突變體對(duì)HBVRNAs體外轉(zhuǎn)錄的影響構(gòu)建adr亞型HBV全基因和4個(gè)ORF(pCMVTNT-P

8、、pCMVTNT-全S、pCMVTNT-全C、pCMVTNT-X)真核表達(dá)質(zhì)粒；以線性DNA為模板，利用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，將hLa及其突變體分別加入各體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，比較體外轉(zhuǎn)錄的RNA的完整性和產(chǎn)量，分析hLa及其突變對(duì)HBVRNAs體外轉(zhuǎn)錄的影響。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，hLa上調(diào)了HBV全基因和P基因的轉(zhuǎn)錄(P＜0.05)，而在全C基因和X基因的轉(zhuǎn)錄中分別出現(xiàn)了顯著的促進(jìn)和抑制作用。DeL1和DeL3對(duì)HBV及其ORF的作用未出現(xiàn)明顯的上調(diào)

9、和抑制作用，DeL2對(duì)HBV全基因和P基因轉(zhuǎn)錄有較弱的下調(diào)作用，但顯著抑制了X基因的轉(zhuǎn)錄(P＜0.01)，推測(cè)hLa的RRM3可能與X基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)。提示hLa對(duì)HBV全基因及其ORF轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的活性差異可能由各ORFRNA的空間結(jié)構(gòu)的差異所致，也與hLa和HBVRNA的作用部位有關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，HBV全基因的轉(zhuǎn)錄優(yōu)于各ORF的轉(zhuǎn)錄，推測(cè)完整的HBV基因組中也可能含有某些活性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。 3.hLa及其突變體對(duì)HBV蛋白表

10、達(dá)的影響以“實(shí)驗(yàn)二”中構(gòu)建的體外轉(zhuǎn)錄翻譯的真核表達(dá)質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，將hLa及其突變體分別加至熒光標(biāo)記的體外翻譯系統(tǒng)中，探討hLa及其突變體等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對(duì)HBV蛋白翻譯啟動(dòng)和病毒復(fù)制的影響。表達(dá)產(chǎn)物分別經(jīng)SDS-PAGE電泳后，采用Typhoon9400熒光掃描儀檢測(cè)結(jié)果；常規(guī)轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HBsAg和HBeAg的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入hLa后HBsAg表達(dá)量明顯上升(P＜0.05)，DeL1對(duì)HBsAg的表達(dá)量也有上調(diào)

11、作用(P＜0.05)，而DeL2和DeL3的作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。全長(zhǎng)HBV表達(dá)HBeAg的量遠(yuǎn)高于C基因的表達(dá)量。此外，hLa明顯下調(diào)了C基因的表達(dá)，而DeL2和DeL3顯著上調(diào)C基因的表達(dá)，表明DeL2和DeL3中缺失的肽段RRM3和RRM2很可能對(duì)全C基因的體外表達(dá)有抑制作用。提示，hLa的不同部位或肽段可能對(duì)HBVRNA的作用效應(yīng)不同。 第三部分HepG2.2.15細(xì)胞中La對(duì)HBV復(fù)制和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響 1.SiR

12、NA的合成與轉(zhuǎn)染針對(duì)hLamRNA序列設(shè)計(jì)特異性SiRNA，體外轉(zhuǎn)錄合成4條La特異性SiRNA，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞，電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg含量變化。結(jié)果表明，HBsAg和HBeAg含量在轉(zhuǎn)染前3天呈逐漸下降趨勢(shì)，而從轉(zhuǎn)染第5天起，隨著RNA干擾效率的降低，HBsAg和HBeAg含量也隨之升高。提示，細(xì)胞內(nèi)La與HBV蛋白表達(dá)有密切關(guān)聯(lián)。 2.細(xì)胞內(nèi)La蛋白與H

13、BV蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制的關(guān)系SiRNA干擾HepG2.2.15細(xì)胞中La的表達(dá)，熒光定量PCR檢測(cè)LamRNA含量，分析特異性SiRNA對(duì)LamRNA的干擾活性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBV-DNA含量變化，分析La與HBV蛋白質(zhì)表達(dá)及病毒復(fù)制的相關(guān)性。結(jié)果顯示：La特異性SiRNA降低了HepG2.2.15細(xì)胞中LamRNA的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后第3天，與正常培養(yǎng)的細(xì)胞相比較，轉(zhuǎn)染siRNA1的細(xì)胞分泌HBsAg下降37.6％，轉(zhuǎn)染siRNA

14、2的下降23.9％，轉(zhuǎn)染SiRNA3的下降38.3％；細(xì)胞分泌HBeAg分別下降49.4％，30.4％和56％；HBV-DNA分別下降32.9％，18.9％和35.6％。SiRNA3的干擾效率最好。對(duì)LamRNA含量變化水平與HBsAg，HBeAg和HBV-DNA的表達(dá)水平變化進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，HBsAg、HBeAg和HBV-DNA變化水平與LamRNA變化水平的相關(guān)系數(shù)分別為0.9382，0.8994，0.7949。表明HBs

15、Ag、HBeAg和HBV-DNA的含量變化水平和LamRNA含量變化水平呈正相關(guān)。提示：在細(xì)胞水平上，La與HBV蛋白表達(dá)和復(fù)制有密切關(guān)聯(lián)。 結(jié)論： 1.本課題針對(duì)hLa及突變體與adr亞型HBVRNA的結(jié)合作用進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：hLa與HBVRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)有親和結(jié)合關(guān)系，DeL1和DeL3的結(jié)合作用減弱，而DeL2顯著降低了結(jié)合親和力。提示，hLa的缺失突變影響其與HBVRNA的結(jié)合，影響程度與突變部位相關(guān)，RRM3

16、可能是hLa發(fā)揮結(jié)合作用的功能域。 2.體外轉(zhuǎn)錄研究表明：hLa上調(diào)HBV全基因和P基因的轉(zhuǎn)錄(P＜0.01)，對(duì)全C基因和X基因的轉(zhuǎn)錄分別出現(xiàn)顯著的促進(jìn)和抑制作用；DeL2和DeL3對(duì)HBV全基因轉(zhuǎn)錄有較弱抑制作用(P值分別為0.017和0.03)；hLa及突變體在全S基因轉(zhuǎn)錄中未見(jiàn)顯著性作用，但下調(diào)了X基因轉(zhuǎn)錄，且DeL2的抑制作用最強(qiáng)。推測(cè)hLa的RRM3與X基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。提示，hLa對(duì)HBV全基因及其ORF轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

17、的活性有差異，可能與各ORFRNA的不同空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。 3.體外翻譯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：hLa促進(jìn)HBsAg表達(dá)、抑制HBeAg表達(dá)；DeL2和DeL3明顯促進(jìn)HBeAg表達(dá)。表明DeL2和DeL3中缺失的肽段可能對(duì)C基因的體外表達(dá)有抑制作用。提示，hLa的不同部位或肽段對(duì)HBVRNA的調(diào)控效應(yīng)不同。 4.在細(xì)胞水平上，探討La與HBV復(fù)制和蛋白表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果表明：La特異性SiRNA降低了HepG2.2.15細(xì)胞中LamRNA

18、的表達(dá)；HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的含量隨LamRNA含量降低而減少。說(shuō)明在HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)，hLa與HBV的復(fù)制和蛋白表達(dá)有密切聯(lián)系。 5.本課題分別在體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)和穩(wěn)定表達(dá)HBV肝癌細(xì)胞中，研究La對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制的影響。結(jié)果表明：hLa與HBVRNA有結(jié)合關(guān)系，hLa突變影響結(jié)合親和力，hLa和突變體的空間結(jié)構(gòu)及HBVRNA的構(gòu)象均不同程度影響HBV轉(zhuǎn)錄和翻譯，RRM3和RRM2都