髓樣細胞分化蛋白抑制乙型肝炎病毒復制的機制研究.pdf

1、固有免疫是機體抗病毒的第一道防線,在機體被病毒感染后通過模式識別相關受體(pattern recognition receptors(PRRs))識別病毒的不同成分從而啟動固有免疫系統(tǒng),在感染發(fā)生的幾分鐘內受體識別這些病原體后激活固有免疫系統(tǒng),產生前炎癥因子抗菌肽和Ⅰ型干擾素。Ⅰ型干擾素會以自分泌和旁分泌的形式與受體結合并激活信號轉導通路。信號通路激活后,干擾素誘導基因(ISG)的表達上調。干擾素誘導基因(ISG)是固有免疫抗病毒和抗腫

2、瘤作用的主要效應分子。干擾素是固有抗病毒的免疫的核心效應分子。重組α-干擾素已經被應用到臨床的抗病毒治療。
　　 乙型肝炎病毒(HBV)是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒,它的復制需經過一個逆轉錄的過程,并可整合到宿主細胞基因組中,引起非細胞病變性感染。在全球范圍內有4億感染者,對人類健康造成極大的危害,α-干擾素(Interferon alpha,IFN-α)是目前少數(shù)臨床治療乙型肝炎有效的藥物之一,但對其抗病毒機制尚未完全明了。為闡明

3、這一作用機制,復旦大學熊偉等,應用人cDNA微點陣芯片檢測了人肝腫瘤細胞(HepG2細胞)和來源于HepG2細胞并整合有HBV基因組的HepG2.2.15細胞經IFN-α處理6小時前后基因表達譜的差異。結果發(fā)現(xiàn),與HepG2細胞相比,在HBV持續(xù)復制的HepG2.2.15細胞中,IFN-α誘導的髓樣細胞分化蛋白(MyD88)的基因表達顯著降低,提示HBV復制可能抑制MyD88基因的表達。進一步應用核苷類似藥物拉米夫定(Lamivudin

4、e)和阿德福韋酯(Adefovir)抑制HepG2.2.15細胞中HBV復制,再用IFN-α處理細胞,發(fā)現(xiàn)HepG2.2.15細胞中MyD88基因的表達顯著增加,由此確認HBV可抑制IFN-α誘導的MyD88基因的表達,這也提示MyD88蛋白可能在IFN-α誘導的抗HBV效應中發(fā)揮重要的作用。目前已知,MyD88蛋白是Toll樣受體(除了TLR3之外,其他TLRs均由MyD88蛋白介導信號傳遞)、白介素-1受體、白介素-18受體介導的信

5、號通路中的關鍵分子,由它參與構成的信號級聯(lián)最終引起核因子kappa B(Nuclearfactor-kappa B,NF-kB)依賴性信號通路的活化。
　　 目的：
　　 熊偉等的研究也表明:在HepG2和Huh7中過表達MyD88蛋白可降低HBV的復制水平。并表明過表達MyDS8蛋白可以激活NF-kB,并且MyD88蛋白對HBV的抑制作用依賴于NF-kB的激活。但是MyD88如何激活NF-kB以及NF-kB激活之后通過

6、什么方式來抑制HBV的復制和蛋白表達,至今還不明了。本課題從MyD88蛋白下游的細胞因子的產生方面來探討MyD88蛋白抑制HBV復制的分子機制。
　　 方法：
　　 因為這一現(xiàn)象首先在HepG2.215細胞內發(fā)現(xiàn),所以在我首先在HepG2.215細胞中確定MyD88的作用,為了解決HepG2.215細胞轉染效率低的問題,我們以連接了MyD88全場序列腺病毒為載體感染HepG2.215細胞,以無關的綠色熒光蛋白(Green

7、-Fluorescent Protien,GFP)作為對照,并用免疫熒光的方法保證了感染的效率,48小時后收細胞,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測上清中的HBsAg和HBeAg的含量,再抽提RNA逆轉錄,以實時熒光定量PCR(Real-timePCR)檢測HBV RNA水平,并用Northern blotting確認結果,抽提乙肝病毒核心顆粒的DNA(HBV Core-particle DNA),用Real-time PCR檢測

8、DNA水平,并用Southern blotting確認。結果發(fā)現(xiàn):與GFP相比,感染了帶有MyD88序列腺病毒的HepG2.215細胞的上清中的HBsAg和HBeAg的含量以及細胞內RNA的含量以及Core particle DNA的含量全面下降。
　　 結果：
　　 MyD88的過表達可以激活NF-kB依賴的信號通路,而NF-kB的活化又可以啟動一序列細胞因子(包括白介素和干擾素)的轉錄,由此,我們觀察了常見的受NF-

9、kB活性調控的細胞因子是否受到MyD88的調節(jié)。由此我們轉染了MyD88之后觀察一些細胞因子的mRNA水平以及上清中分泌的細胞因子的量,結果發(fā)現(xiàn)和其他細胞因子相比,IL-8的表達水平很高,由此我們推測MyD88抑制HBV的復制可能與其誘導IL-8的分泌相關。為確認這一結論,我們進一步測試這些分泌到上清中的細胞因子是否在發(fā)揮抗病毒作用,我們做了上清轉換試驗,即將轉染了空載和MyD88的細胞培養(yǎng)24-48h后上清轉移到轉染了HBV的細胞上再