乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)抑制Fas介導(dǎo)的肝細胞凋亡及機制.pdf

1、TNF-α/TNF-R、FasL/Fas和TRAIL/DR5是介導(dǎo)肝細胞凋亡的三個主要通路，而Fas凋亡通路對于調(diào)控肝細胞死亡與再生最為關(guān)鍵。Fas凋亡系統(tǒng)包括FasL配體和Fas受體。其中，F(xiàn)as受體包括膜型受體（membrane-bound Fas，mFas）以及可溶型受體（soluble Fas，sFas）。mFas受體誘導(dǎo)凋亡，而sFas抑制凋亡。乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein

2、，HBc）可調(diào)控肝細胞凋亡。已有的研究表明，HBc作為基因調(diào)控蛋白，可下調(diào)肝細胞膜凋亡受體DR5的表達，從而抑制TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）誘導(dǎo)的凋亡；HBc還可通過抑制MKK7的磷酸化以促進TNF-α誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。但迄今為止，尚不清楚HBc對Fas介導(dǎo)的肝細胞凋亡是否有影響。因此，本研究旨在系統(tǒng)探討HBc對Fas介導(dǎo)肝細胞凋亡的影響及其機制。本研究分為三個部分：
　

3、　第一部分：旨在探討HBc對Fas介導(dǎo)的肝細胞凋亡的影響。構(gòu)建HBc表達載體pHBc，以空白載體pcDNA3.1/Hygro(+)及pHBc分別轉(zhuǎn)染 HepG2細胞（p53野生型），建立 HepG2-pcDNA3.1空白對照和表達HBc的HepG2-pHBc混合克隆細胞株并驗證其表達。采用CCK-8和TUNEL的方法，發(fā)現(xiàn)了HBc可以降低激動型Fas單克隆抗體anti-Fas CH11對p53野生型HepG2細胞株的毒性并且抑制anti

4、-Fas CH11介導(dǎo)的HepG2細胞株的凋亡。這些結(jié)果表明：HBc可以抑制Fas/FasL通路介導(dǎo)的肝細胞凋亡。進一步研究p53對HBc抑制Fas介導(dǎo)的肝細胞凋亡的影響。為此分別選擇了Huh7（p53突變）和Hep3B（p53缺失）的兩株肝癌細胞株，通過hygromycin分別篩選了Huh7-pHBc，Hep3B-pHBc混合克隆細胞株并驗證了HBc的表達（對照株分別為 Huh7-pcDNA3.1及 Hep3B-pcDNA3.1）。C

5、CK-8和TUNEL實驗表明anti-Fas CH11處理沒有對Huh7和Hep3B混合克隆細胞株產(chǎn)生毒性和凋亡效應(yīng)，并且HBc組和對照組無顯著性差異。另外，在anti-Fas CH11處理之前，分別使用 p53抑制劑 PFT-α以及 p53誘導(dǎo)劑 Bleomycin處理HepG2-pHBc和 HepG2-pcDNA3.1，結(jié)果顯示 PFT-α處理導(dǎo)致 HepG2-pHBc和HepG2-pcDNA3.1凋亡率極低并且無顯著性差異，而Bl

6、eomycin處理導(dǎo)致HepG2細胞株整體凋亡率增加并且HepG2-pcDNA3.1凋亡率高于HepG2-pHBc。以上結(jié)果說明HBc抑制Fas介導(dǎo)的肝細胞的凋亡具有p53依賴性。
　　第二部分：旨在探討HBc對p53，總Fas，mFas（膜型Fas）以及FasL轉(zhuǎn)錄和表達的影響。為此，采用Real-time RT-PCR和Westernblot檢測HepG2-pHBc和HepG2-pcDNA3.1細胞株中p53，總Fas，mFa

7、s以及FasL的mRNA和蛋白水平的差異。我們發(fā)現(xiàn)Bleomycin可以上調(diào)p53和mFas的mRNA和蛋白水平，而HepG2-pHBc組p53和mFas的mRNA和蛋白水平低于對照組。Bleomycin可以上調(diào)總Fas和FasL的mRNA水平，而HepG2-pHBc組總Fas和FasL的mRNA水平低于對照組。以上結(jié)果表明：HBc可以下調(diào)FasL和總Fas的轉(zhuǎn)錄，并且下調(diào)p53和mFas的mRNA和蛋白水平。
　　第三部分：旨在

8、探討HBc對sFas（可溶性Fas）轉(zhuǎn)錄和表達的影響。采用Semi-quantitative RT-PCR和ELISA檢測HepG2-pHBc和HepG2-pcDNA3.1細胞sFas的mRNA和蛋白水平的差異，發(fā)現(xiàn)HepG2-pHBc組sFas的mRNA和蛋白水平高于對照組。Bleomycin也可增加sFas的mRNA和蛋白水平。另外，F(xiàn)as剪接實驗提示：HepG2-pHBc組的Fas exon5/7（代表sFas）高于對照組，Ble

9、omycin降低Fas exon5/7水平。以上結(jié)果表明：HBc可以上調(diào)sFas的mRNA和蛋白水平。進一步探討HBc上調(diào)sFas基因轉(zhuǎn)錄及表達的機制，即Fas選擇性剪接的機制。為此，采用Real-time RT-PCR和Westernblot檢測HepG2-pHBc和 HepG2-pcDNA3.1細胞株中 PTBP1、PTBP2、PTBP3、FASTK及TIA-1、TIAR的mRNA和蛋白水平的變化，采用Western blot檢測p

10、rocaspase-3和active caspase-3蛋白水平的變化，采用caspase-3活性實驗檢測caspase-3的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2-pHBc組的PTBP1蛋白水平高于對照組，但PTBP2和PTBP3的蛋白水平和對照組相比無變化，HepG2-pHBc組PTBP1，PTBP2和PTBP3的轉(zhuǎn)錄和對照組相比無明顯變化。HepG2-pHBc組active caspase-3活性低于對照組。HepG2-pHBc組 FASTK啟