乙型肝炎病毒X蛋白表觀沉默Wnt信號拮抗因子SFRPs及促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生的分子機制.pdf

1、目的:肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是我國HCC發(fā)生的主要病因。乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus Xprotein，HBx)由HBV基因組中最小的開放讀碼框編碼，作為一個多功能調(diào)節(jié)蛋白，HBx在HBV感染相關(guān)肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。研究表明，HBx可以直接活化多種原癌基因或抑制

2、抑癌基因（如c-myc、c-jun、p21、p53等）的轉(zhuǎn)錄，也可以激活多種信號通路（如Wnt、PI3K、JNKs、MAPK/ERK等），從而影響細(xì)胞增殖和分化等多種生物學(xué)行為，參與肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程，但是其具體的分子機制不明。
　　Wnt信號通路是真核生物進(jìn)化過程中一條高度保守的信號通路，是調(diào)控胚胎早期發(fā)育的重要信號分子，對維持成體干細(xì)胞的自我穩(wěn)定性也發(fā)揮了重要作用。Wnt信號通路的異?；罨c人類多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，而其異

3、?；罨辽倥c50％以上的HCC發(fā)生相關(guān)。除了CTNNB1(β-catenin)、APC、AXIN1以及AXIN2基因突變直接激活Wnt信號通路外，其他相關(guān)調(diào)控因子的異常，也參與其異常活化。
　　分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)是Wnt信號的主要胞外抑制因子，其通過競爭性抑制Wnt配體與Frizzled受體結(jié)合，阻斷Wnt信號通路的活化。研究證實，多種腫瘤的發(fā)生與

4、SFRPs基因的表達(dá)下調(diào)相關(guān)，而SFRPs基因的表達(dá)下調(diào)與其啟動子區(qū)高甲基化修飾密切相關(guān)。目前，在許多實體腫瘤如肝癌、肺非小細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)腸癌等中均發(fā)現(xiàn)了SFRPs基因啟動子區(qū)高甲基化修飾。
　　近年來研究表明，病毒感染機體后，其編碼蛋白能夠以表觀遺傳修飾的方式直接調(diào)控宿主重要基因的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞增殖、分化以及侵襲等多種細(xì)胞生物學(xué)行為，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如HCV核心蛋白以及NS5A蛋白等。但是，HBx能否以表觀遺傳修飾方

5、式調(diào)控SFRPs的表達(dá)從而參與HBV相關(guān)疾病的發(fā)生，目前還無相關(guān)報道。課題組前期實驗證實:在多種肝癌細(xì)胞中，HBx能夠明顯下調(diào)SFRP1和SFRP5的表達(dá)，甲基化抑制劑5-氮-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，DAC)處理細(xì)胞后，SFRPs的表達(dá)能夠得到部分回復(fù)。本研究擬深入分析HBx表觀調(diào)控SFRPs的具體分子機制，并在體內(nèi)實驗中觀察HBx表觀調(diào)控SFRPs后對荷瘤鼠的增殖及侵襲力的影響，從而探討HBV感染

6、后病毒編碼蛋白HBx異?；罨疻nt信號通路，并參與肝細(xì)胞癌發(fā)生的分子機制。
　　方法:1）通過免疫共沉淀(immunoprecipitation，IP)、染色質(zhì)免疫共沉淀實驗（chromatin immunoprecipitation，ChIP）觀察HBx調(diào)控SFRP1、SFRP5基因啟動子區(qū)甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)、組蛋白去乙?；揎椕福╤istone deacetylases，H

7、DACs）的結(jié)合變化;用DAC和/或曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)處理細(xì)胞后，檢測上述表觀修飾蛋白在SFRP1、SFRP5基因啟動子區(qū)的結(jié)合變化，深入研究HBx表觀調(diào)控SFRP1、SFRP5基因轉(zhuǎn)錄的分子機制;2)在HBV感染的肝癌組織標(biāo)本中，采用Real-time PCR及多因素關(guān)聯(lián)分析，探討SFRP1、SFRP5的表達(dá)水平或啟動子區(qū)甲基化修飾狀態(tài)與DNMT1表達(dá)的相關(guān)性;3）在穩(wěn)定表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞系中，通過

8、Western blot和免疫熒光實驗，觀察沉默DNMT1或過表達(dá)SFRP1、SFRP5后，對Wnt信號通路活化以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）發(fā)生關(guān)鍵分子表達(dá)的影響;4）在荷瘤小鼠模型中進(jìn)一步驗證沉默DNTM1或過表達(dá)SFRPs后，肝癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的改變，并探討其可能的分子機制。
　　結(jié)果:通過IP實驗證實:HBx可以與DNMT1、DNMT3A以及HDAC1直接

9、結(jié)合。ChIP實驗表明，HBx能夠誘導(dǎo)DNMT1、DNMT3A以及甲基化結(jié)合蛋白(methyl-CpG binding domain protein，MBD)富集于SFRP1、SFRP5基因啟動子區(qū)，而組蛋白H3(acetylated histone H3，AcH3)的乙酰化修飾水平以及乙?；D(zhuǎn)移酶P300在其啟動子區(qū)結(jié)合明顯降低。單獨用DAC或TSA處理細(xì)胞，能夠抑制DNMT1、MBD1、MBD2與SFRP1、SFRP5啟動子區(qū)的結(jié)合

10、，同時組蛋白H3乙酰化水平及P300的結(jié)合得到有效回復(fù)，DAC與TSA聯(lián)合處理后，上述效應(yīng)明顯增強。
　　乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌組織標(biāo)本中SFRP1和SFRP5表達(dá)明顯下降，并與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。SFRP1、SFRP5啟動子區(qū)甲基化修飾水平與DNMT1的表達(dá)呈正相關(guān)。多因素關(guān)聯(lián)分析表明，肝癌組織中SFRP1和SFRP5表達(dá)水平與肝癌組織的分化程度呈正相關(guān)，提示SFRPs的表達(dá)下調(diào)參與肝癌惡性轉(zhuǎn)化的早期過程。

11、
　　Western blot和免疫熒光實驗證實，沉默DNMT1或過表達(dá)SFRP1、SFRP5能夠抑制Wnt信號重要分子β-catenin以及相關(guān)靶基因c-myc、cyclinD1的表達(dá)，并可以逆轉(zhuǎn)HBx誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程。
　　荷瘤鼠皮下成瘤實驗發(fā)現(xiàn)，沉默DNMT1或者過表達(dá)SFRP1、SFRP5，能夠抑制裸鼠皮下移植瘤的生長速度及腫瘤大小，并且可以下調(diào)Wnt信號效應(yīng)分子β-catenin、增殖相關(guān)抗原PCNA以及侵襲相關(guān)分

12、子VEGF、MMP9的表達(dá)。
　　結(jié)論:HBx通過誘導(dǎo)DNMT1、DNMT3A以及HDAC1富集于SFRP1、SFRP5基因啟動子區(qū)，使其啟動子高甲基化修飾，從而沉默SFRP1和SFRP5的表達(dá)。體內(nèi)外實驗證實HBx通過下調(diào)SFRP1和SFRP5的表達(dá)，誘導(dǎo)Wnt信號通路異?；罨?，并加速EMT的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖與侵襲，參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生。本研究為闡明HBV感染相關(guān)HCC的發(fā)病機制提供了新的理論依據(jù)，同時為研發(fā)新的針對wnt信號