乙型肝炎病毒X蛋白相關(guān)原發(fā)性肝癌發(fā)生中的表觀遺傳學(xué)機制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于所有癌癥的第五位，且其死亡率為所有癌癥死亡率的第三位，嚴(yán)重威脅著人類健康。而肝癌發(fā)生的一個最主要的危險因素就是肝炎病毒感染，流行病學(xué)資料顯示50-55％的原發(fā)性肝癌發(fā)生是由于持續(xù)性的乙型肝炎病毒(HBV)感染引起。由HBV導(dǎo)致的慢性感染者全世界約有4億人，其中50％的男性攜帶者和14％的女性攜帶者最終會死于慢性感染導(dǎo)致的肝硬化和原發(fā)性肝細胞肝癌(HCC)等并發(fā)癥。目前人們對肝癌的發(fā)

2、病機制并不十分清楚。過去人們普遍認(rèn)為遺傳學(xué)上的基因突變是腫瘤發(fā)病機制中的關(guān)鍵事件，尤其是抑癌基因的體細胞突變與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。但是，近年來隨著對腫瘤認(rèn)識的深入，人們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也起到非常重要的作用。由遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變引起的原癌基因的活化和抑癌基因的滅活共同引起細胞惡性改變，表觀遺傳學(xué)修飾的改變甚至早于遺傳學(xué)改變在癌前期即開始出現(xiàn)。HBX作為HBV基因組中最小的開放閱讀框，同時也是結(jié)構(gòu)和功能上

3、重疊最明顯的區(qū)域，編碼產(chǎn)生的HBx蛋白被認(rèn)為與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。它可以作為原癌基因或者共同作用因子促進腫瘤的發(fā)生，最近的研究顯示HBx還參與了肝癌發(fā)生中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控。
　　 HBx可以通過上調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的活性導(dǎo)致基因啟動子區(qū)的甲基化從而促進肝癌的發(fā)生。但是HBx激活DNMTs的機制仍然不清楚。Micro RNAs(miRNAs)是一類長度約19-25個堿基的單鏈非編碼小分子RNA，它可以通過靶基因m

4、RNA的3'-UTR區(qū)完全或不完全的互補結(jié)合后導(dǎo)致靶基因降解或抑制其翻譯，來調(diào)節(jié)基因的表達。在生物體內(nèi)發(fā)揮著許多重要作用，包括參與生物體的發(fā)育，分化，增殖，凋亡，應(yīng)激反應(yīng)等，研究顯示miRNAs表達譜的改變在包括腫瘤的許多人類疾病的發(fā)生中都起著重要的作用。一些miRNAs可能作為原癌基因或者抑癌基因發(fā)揮作用。而越來越多的證據(jù)顯示miRNAs與DNA甲基化有著互相調(diào)節(jié)關(guān)系，可以互為靶向。
　　 在本課題中，我們研究了在HBV相關(guān)性

5、肝癌中是否存在著異常表達的能調(diào)控機體DNA甲基化狀態(tài)的miRNAs，參與了腫瘤的發(fā)生過程。本實驗室的前期研究中基于HBx轉(zhuǎn)基因小鼠及對照野生型C57/BL6小鼠肝臟組織miRNA芯片發(fā)現(xiàn)miR-152在HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟組織中表達量發(fā)生明顯下調(diào)。而通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，DNMT1可能是miR-152的靶基因。隨后我們通過體外雙熒光素酶報告基因檢測證明miR-152可以通過直接與DNMT1的3’-UTR區(qū)發(fā)生互補結(jié)合，從而靶向抑制其

6、mRNA和蛋白表達水平，并調(diào)控機體的DNA甲基化狀態(tài)。病人組織檢測結(jié)果也顯示miR-152的表達量在HBV相關(guān)性肝癌組織中比對應(yīng)的癌旁組織發(fā)生了頻繁的顯著下調(diào)，且miR-152的表達量與DNMT1的mRNA表達負(fù)相關(guān)。細胞水平實驗證明在HepG2.2.15細胞中過表達miR-152可以導(dǎo)致基因組整體DNA甲基化水平(GDM)的下降；而相反的，在HepG2細胞中，miR-152的抑制劑可以導(dǎo)致細胞的GDM上升，以及腫瘤抑制基因GSTP1和

7、CDH1的啟動子區(qū)甲基化水平顯著上升而抑制其表達，從而促進腫瘤的發(fā)生。
　　 本實驗證明了miR-152參與了HBV相關(guān)性肝癌發(fā)生中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生中起到抑癌基因的作用，豐富了HBV-HCC的發(fā)病機制。并首次在消化系統(tǒng)疾病中報道m(xù)iRNA可以調(diào)控DNA甲基化，為豐富不同表觀遺傳學(xué)修飾之間的相互調(diào)控機制，以及理解表觀遺傳學(xué)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)起到了積極的作用。我們同樣相信我們的發(fā)現(xiàn)對潛在的相關(guān)治療可以產(chǎn)生積極的影響意義。本

8、研究的結(jié)果為發(fā)展使用外源合成的miR-152作為表觀遺傳學(xué)藥物治療HBV相關(guān)性肝癌提供了有力的理論支持。miR-152可以單獨使用或者與其他藥物聯(lián)合使用，它可以通過重新激活腫瘤抑制基因以及糾正腫瘤細胞的異常DNA甲基化模式，來達到治療腫瘤的目的，為HBV-HCC提供了新的miRNA藥物治療靶點。
　　 除了小RNA分子，近年來，另一類長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)也逐漸進入人們的視角。l

9、ncRNAs是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子，它們本身并不編碼蛋白或者只是編碼很短的多肽。近年來，越來越多的研究表明lncRNAs在表觀遺傳學(xué)調(diào)控領(lǐng)域也有著非常重要的作用，它可以通過各種不同的機制調(diào)控基因的表達水平，參與基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白功能調(diào)節(jié)等多種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控過程。lncRNAs參與調(diào)控了多種生理病理學(xué)過程，參與了各種疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。那么HBV是否可以通過影響lncRNA

10、s的表達來促進腫瘤的發(fā)生呢?
　　 在本研究中，我們還從HBx轉(zhuǎn)基因鼠角度入手，消除其他干擾因素，研究了HBV對lncRNAs的表達影響，以及l(fā)ncRNAs在HBV-HCC發(fā)生中的作用及其分子機制。本實驗中我們使用lncRNAs芯片技術(shù)篩選到一批在HBx轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中比野生型小鼠發(fā)生顯著差異的lncRNAs，并且用實時定量PCR技術(shù)擴大樣本量對它們在不同年齡和性別的轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠肝臟組織中的表達量進行了驗證。證實了HB

11、x確實可以影響機體的lncRNAs表達，說明HBV感染者可能有著其特異的lncRNAs表達譜，而且其中很多l(xiāng)ncRNAs表達變異在感染的早期未發(fā)生腫瘤時就已經(jīng)出現(xiàn)，提示它們的表達差異可能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)HBx誘導(dǎo)下調(diào)的lncRNA-AK050349，可以與vimentin蛋白發(fā)生相互結(jié)合并影響其結(jié)構(gòu)，從而改變正常的細胞骨架結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)外促進腫瘤的增殖和遷移。
　　 我們的研究證明了HBx相關(guān)的lncRNAs在原發(fā)