酶切富集PCR-焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)NSCLC患者癌組織及外周血KRAS基因突變.pdf

1、背景與目的:
　　多項(xiàng)多中心臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),對(duì)于發(fā)生EGFR敏感突變的NSCLC患者,表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor- tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)可明顯延長(zhǎng)患者的無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)及總生存期(overall survival,OS),但KRAS基因突變與患者對(duì)TK

2、I的原發(fā)耐藥密切相關(guān),因此在進(jìn)行 EGFR檢測(cè)的同時(shí),進(jìn)行 KRAS基因突變檢測(cè)能進(jìn)一步增強(qiáng) TKI靶向治療的的針對(duì)性。目前很多檢測(cè)技術(shù)已用于KRAS基因的檢測(cè),但是多數(shù)檢測(cè)方法成本高、操作繁瑣、主觀性強(qiáng),缺乏臨床實(shí)用性。因此,本研究建立簡(jiǎn)便、高靈敏度的酶切富集-PCR聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù),檢測(cè)NSCLC患者癌組織與外周血中KRAS突變情況,用于臨床NSCLC患者的靶向治療篩查,為選擇最佳用藥人群提供依據(jù)。
　　方法:
　　收

3、集晚期NSCLC患者癌組織及配對(duì)的外周血樣本43例,運(yùn)用酶切富集-PCR聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù),檢測(cè)癌組織及配對(duì)的外周血樣本中 KRAS基因常見的12、13密碼子突變情況,通過(guò)以不同比例混合KRAS突變型細(xì)胞系A(chǔ)549和KRAS野生型細(xì)胞系HCC827,測(cè)定酶切富集-PCR聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)的靈敏度;分析癌組織與其配對(duì)的外周血標(biāo)本突變狀態(tài)的一致性,建立一種可以經(jīng)外周血檢測(cè)KRAS基因突變的檢測(cè)手段。
　　結(jié)果:
　　1.在配對(duì)的

4、43例NSCLC患者癌組織中檢測(cè)到4例KRAS基因突變,均為12密碼子突變;2例突變類型為GGT→AGT,2例突變類型為GGT→GAT;突變率為9.3％(4/43)。
　　2.在配對(duì)的43例NSCLC患者外周血樣本中檢測(cè)到3例KRAS基因突變,均為12密碼子突變;2例突變類型為GGT→AGT,1例突變類型為GGT→GAT;突變率為7%(4/43)。以癌組織樣本中的KRAS基因突變?yōu)榛鶞?zhǔn),突變一致性為75.0%(3/4)。
　

5、　3.按不同比例混合 KRAS基因野生型的 HCC827細(xì)胞株與KRAS基因突變型的A549細(xì)胞株,當(dāng)混合比例小于1000:1時(shí),可觀察到突變峰,表明酶切富集-PCR聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)的靈敏度為0.1%。
　　結(jié)論:
　　1.晚期NSCLC患者存在KRAS基因突變,其癌組織突變率為9.3%。
　　2.晚期NSCLC患者癌組織和外周血中KRAS基因突變狀態(tài)具有高度的一致性,提示在組織取材困難的情況下,外周血樣本可以替代組

6、織樣本進(jìn)行基因檢測(cè);在行分子靶向治療前,外周血中KRAS基因突變狀態(tài)也可以作為一個(gè)有效的參考指標(biāo)。
　　3.本實(shí)驗(yàn)成功地建立了酶切富集 PCR-焦磷酸測(cè)序檢測(cè) NSCLC患者癌組織及外周血 KRAS基因突變技術(shù)。酶切富集-PCR通過(guò)引入特異的限制性內(nèi)切酶,能更有效地使KRAS突變基因得到富集;在此基礎(chǔ)上,聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù),能大樣本、高通量、精確地檢測(cè)KRAS基因突變,能有效為NSCLC患者是否適合TKI治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),給患者帶