NSCLC患者胸腔積液EGFR-KRAS基因突變的方法及臨床意義.pdf

1、背景：
　　 近年來(lái)，我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢(shì)，每年新發(fā)病人大約有50萬(wàn)例，并以年5%的速度遞增，其中75%-80%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancerNSCLC)，總的5年生存率不到15%。而伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期NSCLC，自然病程的中位生存期只有4-5個(gè)月，1年生存期不足10%。以手術(shù)、化療和放療為主的傳統(tǒng)治療方法已進(jìn)入一個(gè)瓶頸期，而分子靶向治療正逐漸成為晚期NSCLC的重要手段。

2、許多大型臨床試驗(yàn)表明，以表皮生長(zhǎng)因子受體的酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)為代表的分子靶向治療可延長(zhǎng)患者的生存期，但EGFR-TKI的療效與EGFR/KRAS基因的狀態(tài)密切相關(guān)。其中EGFR的18、19、21外顯子突變及20外顯子T790M突變分別是EGFR-TKI的敏感和耐藥指標(biāo)，KRAS基因突變則是EGFR-TKI的耐藥指標(biāo)。因此，在接受TKI治療前進(jìn)行EGFR/KRAS基因狀態(tài)檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)靶向治療非常重要。目前，NSCLC分子靶

3、點(diǎn)EGFR/KRAS基因檢測(cè)多為手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本。然而，臨床上，常常遇到無(wú)法獲得腫瘤組織標(biāo)本的情況，EGFR/KRAS基因檢測(cè)成為困難，嚴(yán)重限制了NSCLC患者的分子靶向治療選擇。因此，探索組織標(biāo)本的良好替代物及其檢測(cè)方法，在NSCLC臨床診治中勢(shì)在必行，具有非常重要的臨床意義。
　　 目的：
　　 本研究旨在通過(guò)對(duì)伴有胸腔積液的NSCLC患者進(jìn)行胸水EGFR/KRAS基因檢測(cè)，建立非組織來(lái)源EGFR/KRAS檢測(cè)

4、的替代方法，并探討胸水EGFR/KRAS突變狀態(tài)的臨床意義，證實(shí)EGFR/KRAS基因突變與臨床靶向治療療效的關(guān)系，為分子靶向治療療效預(yù)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書(shū)。收集我科2011年3月至2012年3月符合納入標(biāo)準(zhǔn)的NSCLC(Ⅳ期，UICC，2009版)，NSCLC合并胸腔積液的胸水標(biāo)本共63例，NSCLC病理組織樣本64例，其中與胸水相互配對(duì)的組織標(biāo)

5、本24例。用QIAGEN公司的體液及組織DNA提取試劑盒對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行DNA提取，用焦磷酸測(cè)序儀對(duì)全部63例胸水標(biāo)本及64例組織標(biāo)本的EGFR/KRAS突變狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)分析。另隨機(jī)選取其中30例胸水標(biāo)本用鎖核酸PCR桑格測(cè)序法(Locked
　　 Nucleic Acids probes Polymerase Chain Reaction LNA-PCR-Sanger)檢測(cè)KRAS基因狀態(tài)，與焦磷酸測(cè)序進(jìn)行對(duì)比，分析不同檢測(cè)方法

6、的敏感性。
　　 采用卡方檢驗(yàn)法比較不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果一致性、不同來(lái)源的標(biāo)本EGFR/KRAS突變的一致性；比較EGFR/KRAS突變狀態(tài)與患者性別、年齡、吸煙史、病理類型的關(guān)系；建立入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)接受靶向治療患者進(jìn)行分析，觀察EGFR/KRAS基因狀態(tài)與TKI療效的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.胸腔積液EGFR基因突變的焦磷酸測(cè)序檢測(cè)
　　 焦磷酸測(cè)序法在63例胸腔積液樣本中檢測(cè)出EGFR

7、突變19例(30.16%)，全部為EGFR19/21外顯子突變，其中EGFR19缺失突變10例(總突變的52.63%)，EGFR21外顯子L858R突變9例(總突變的47.37％)。
　　 2.胸腔積液KRAS基因突變的焦磷酸測(cè)序和LNA-PCR-Sanger檢測(cè)
　　 焦磷酸測(cè)序在63例胸水樣本中檢測(cè)出KRAS突變率為7.93％(5/63)。12號(hào)密碼子4例，均為GGT>GAT突變，p.G12D c.35G>A，1例1

8、3號(hào)密碼子GGC>GAC突變，p.G13Dc.38G>A，12號(hào)密碼子突變率占總突變的80%。而LNA-PCR-Sanger法測(cè)序，檢測(cè)的30例胸水樣中KRAS突變?yōu)?例，突變率為20%(6/30)，其中12號(hào)密碼子突變4例，3例為GGT>GAT突變，p.G12D c.35G>A，1例為GGT>TGT突變，p.G12C c.34G>T，另2例為第14號(hào)密碼子GTA>ATA，12號(hào)密碼子突變占總突變的66.67％。LNA-PCR-Sang

9、er法測(cè)序檢測(cè)出KRAS突變的陽(yáng)性高于焦磷酸法，但P=0.093，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序和LNA-PCR-Sanger檢測(cè)的樣本共30例，焦磷酸測(cè)序檢出KRAS突變?yōu)?例，全部為12號(hào)密碼子突變，GGT>GAT突變，p.G12D c.35G>A，突變率10.00％(3/33)，與LNA-PCR-Sanger檢測(cè)法結(jié)果比較，P=0.470，也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.腫瘤組織的EGFR/KARS基因突變檢測(cè)及與胸腔積液檢

10、測(cè)結(jié)果的比較
　　 利用焦磷酸測(cè)序?qū)?4例NSCLC組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，EGFR基因突變率為34.38%(22/64)，與胸腔積液EGFR突變檢檢出率30.16%(19/63)比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.705)。
　　 其中配對(duì)的組織和胸腔積液樣本24例EGFR突變率分別為37.50％(9/24)和33.33%(8/24)，P=0.500，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 利用焦磷酸測(cè)序?qū)?4例組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，KRAS基因

11、突變率為4.69%(3/64)，12號(hào)密碼子突變2例，占66.7%，13號(hào)密碼子突變1例，占33.3％。與胸腔積液KRAS突變檢檢出率(7.93%，5/63)比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.350)。
　　 其中配對(duì)的組織和胸腔積液樣本24例KRAS突變率分別為12.5％(3/24)和8.33％(2/24)，P=0.500，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.EGFR基因檢測(cè)與臨床相關(guān)指標(biāo)分析
　　 組織樣本和胸水標(biāo)本EGFR

12、基因突變與吸煙史(組織P=0.013，胸水P=0.014)、病理組織學(xué)類型(組織P=0.022，胸水P=0，020)相關(guān)，非吸煙者、肺腺癌患者更易發(fā)生EGFR基因突變。用RECIST標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)接受TKI靶向治療的18例患者進(jìn)行了療效評(píng)價(jià)，其中EGFR敏感性突變(19外顯子缺失突變和21外顯子L858R)共5例，TKI治療后無(wú)CR，PR5例，緩解率RR(CR+PR)為100%；EGFR野生型共13例，TKI治療后無(wú)CR，PR為5例，SD3例

13、，PD5例，緩解率RR(CR+PR)為38.5%。與EGFR野生型患者相比，EGFR敏感性突變患者對(duì)TKI臨床療效更加敏感，二者有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.029)。
　　 5.KRAS基因檢測(cè)與臨床相關(guān)指標(biāo)分析
　　 組織樣本和胸水標(biāo)本KRAS基因突變與患者的性別、年齡、病例組織學(xué)類型、吸煙史等臨床病理特征均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。用RECIST標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)接受TKI靶向治療的18例患者進(jìn)行了療效評(píng)價(jià)，其中KRA

14、S基因突變共1例，達(dá)到PR，緩解率RR(CR+PR)為100%；KRAS野生型患者共17例，TKI治療后無(wú)CR，達(dá)到PR為9例，SD3例，PD5例，緩解率RR(CR+PR)為56.25%。KRAS基因突變與TKI療效無(wú)明顯關(guān)系(P=0.556)。該結(jié)果與KRAS突變?yōu)門KI原發(fā)性耐藥的西方文獻(xiàn)報(bào)道有所不同，表明KRAS突變與否與TKI臨床療效相關(guān)性可能存在地區(qū)差異，需要更大樣本的進(jìn)一步證實(shí)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在無(wú)

15、法獲取組織標(biāo)本的情況下，胸腔積液可成為NSCLC患者的EGFR/KRAS檢測(cè)良好的替代。
　　 2.焦磷酸測(cè)序可作為EGFR基因突變的檢測(cè)方法；LNA-PCR-Sanger測(cè)序和焦磷酸測(cè)序法均可作為胸腔積液的KRAS突變檢測(cè)，前者更為敏感。
　　 3.與EGFR野生型相比，EGFR基因19、21外顯子突變對(duì)TKI治療更敏感。
　　 4.LNA-PCR-Sanger法檢測(cè)出KRAS突變陽(yáng)性率高于文獻(xiàn)報(bào)道，KRAS突