肺癌EGFR的基因突變檢測方法研究.pdf

1、目的：探討利用β-GAL相關LacZ基因插入片段閱讀框是否含有終止密碼子結合藍白篩選檢測EGFR基因缺失突變的可行性，利用高保真聚合酶介導的突變敏感性分子開關檢測EGFR基因熱點突變，從而指導肺癌患者酪氨酸激酶抑制劑的合理用藥。
　　方法：在Genebank中查找EGFR基因19號外顯子野生型基因序列，查找pMD19-T質粒LacZ基因序列，根據文獻已經報道過的常見的致病突變△E746–A750和△L747–P753（insS），

2、設計普通 PCR引物和硫化修飾檢測引物，利用重疊延伸 PCR方法構建野生型質粒模板EA和△E746–A750突變質粒模板D15、△L747–P753突變質粒模板 D18，藍白篩選轉化野生質粒和缺失突變質粒，隨后對10份臨床肺癌病人血中游離DNA樣本進行藍白篩選，檢測是否含有EGFR基因△E746–A750或△L747–P753突變,并測序鑒定藍白篩選方法的可靠性。隨后我們對10份臨床組織DNA樣本進行鑒定，最后用本課題組開發(fā)的高保真聚合

3、酶介導的突變敏感性分子開關分別結合瓊脂糖凝膠電泳與熒光定量PCR技術分別對10份臨床組織DNA樣本進行EGFR基因△E746–A750或△L747–P753突變的定性與定量檢測。
　　結果：在 LB顯色固體培養(yǎng)基上，野生質粒 EA的菌落均為白色，而 D15，D18突變質粒的菌落均為藍色。10份臨床血中游離DNA樣本構建的重組質粒菌落顏色均為大量白色，少量藍色，挑選藍色菌落進行測序，可以檢測出含有15bp缺失，未檢出18bp缺失，對

4、檢出15bp缺失突變對應的肺癌組織DNA樣本進行測序驗證，顯示組織樣本EGFR基因存在15bp缺失突變，與藍白篩選結果吻合。高保真聚合酶介導的分子開關結合瓊脂糖凝膠電泳檢測10份臨床肺癌組織樣本顯示，樣本2、4、6號未檢測到EGFR基因15bp缺失，其余均檢測出EGFR基因15bp缺失，且所有樣本均未為檢測出EGFR基因18bp缺失。分子開關結合熒光定量PCR結果顯示除6號樣本外所有樣本均出現EGFR基因15bp缺失，拷貝數在103-1