體內(nèi)Pig-a基因突變檢測方法研究.pdf

1、隨著新藥不斷上市及對藥品安全性的日益重視，作為藥物非臨床研究的重要組成部分的遺傳毒性檢測，其檢測新技術和新方法的開發(fā)成了當務之急。遺傳毒性研究包括體內(nèi)實驗和體外實驗，采用不同的實驗系統(tǒng)預測和評價藥物的潛在遺傳毒性，從而降低藥物在人體臨床實驗中的風險。
　　遺傳毒性試驗中的體內(nèi)實驗非常重要，尤其體現(xiàn)在后續(xù)實驗策略對試驗方法的選擇上，ICH、OECD關于遺傳實驗的指導原則對此有很明確的闡述。同時，為了體現(xiàn)動物實驗的3R原則，在開發(fā)新的

2、體內(nèi)實驗方法時盡可能將其結合在一般毒性實驗中，實現(xiàn)多終點檢測，最終達到減少動物使用量的目的。本研究針對現(xiàn)階段遺傳毒性研究的現(xiàn)狀，建立新的遺傳毒性體內(nèi)檢測基因突變的快捷方法，以達到上述目的。
　　本研究為建立 SD大鼠體內(nèi) Pig-a基因突變實驗方法開展了相關基礎研究，并將其應用于藥物安全性評價中。Pig-a基因是糖化磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidyl inositol，GPI）合成的關鍵基因，GPI合成障礙會導致

3、細胞表面 GPI錨連蛋白（CD59、CD55、CD48等）缺失或缺損，突變表型細胞發(fā)生率（即 RBCCD59-發(fā)生率）可通過流式細胞儀檢測得到，進而得到 Pig-a基因突變率。
　　1.研究目的和方法
　　本研究分包括 Pig-a基因突變實驗方法的建立和Pig-a基因突變實驗方法的應用二部分。研究內(nèi)容如下：
　　第一部分：實驗方法的建立和優(yōu)化。1）選用ENU作為陽性致突變劑，并與DMBA給藥組進行比較分析。確定合適陽性

4、劑、給藥劑量（分為低劑量連續(xù)給藥組、高劑量連續(xù)給藥組、大劑量單次給藥組）、最佳檢測時間等因素。2）分別選用5周齡和9周齡 SD雄性大鼠進行自發(fā)和誘發(fā) Pig-a基因突變實驗，并進行背景數(shù)據(jù)收集。從而研究實驗動物周齡對Pig-a基因檢測實驗的影響。3）從樣本重復性檢測分析、染色細胞穩(wěn)定性分析、血樣穩(wěn)定性分析、流式細胞儀檢測準確性分析等方面對Pig-a基因突變實驗方法進行驗證。
　　第二部分：實驗方法的應用。1）選用兩種抗腫瘤藥順鉑注

5、射液和鹽酸甲基芐肼進行檢測。2）兩種中藥主要藥理毒理成分馬兜鈴酸 A和雷公藤甲素進行檢測。
　　2.研究結果
　　1）SD大鼠經(jīng) ENU暴露后，在末次給藥后28天進行檢測，低劑量連續(xù)給藥組、高劑量連續(xù)給藥組、大劑量單次給藥組均得到陽性結果，RBCCD59-發(fā)生率分別為溶媒對照組的5.1倍、13.9倍和6.7倍。2）SD大鼠經(jīng) DMBA（40mg/kg/day）和ENU（100mg/kg/day）暴露后，在末次給藥后28天進行

6、檢測，RBCCD59-發(fā)生率分別為溶媒對照組的8.8倍和17.2倍；在末次給藥后56天，分別為溶媒對照組的25.8倍和37.4倍。3）5周齡和9周齡大鼠經(jīng) ENU（100mg/kg/day）暴露，28后 RBCCD59-發(fā)生率分別為溶媒對照組的17.2倍和11.5倍。4）SD大鼠給予順鉑注射液(2mg/kg/day和5mg/kg/day)，末次給藥后28天檢測，未能得到陽性結果；SD大鼠給予鹽酸甲基芐肼(100mg/kg/day)，末次

7、給藥28天后 RBCCD59-發(fā)生率為溶媒對照組的3.4倍，并存在顯著性差異（P<0.01）。5) SD大鼠給予馬兜鈴酸 A（20mg/kg/day）和雷公藤甲素（0.45mg/kg/day），28天檢測均未得到陽性結果，延長檢測時間至56天，亦未得到陽性結果。
　　3.結論
　　1）實驗選用了兩種遺傳毒性檢測常用的誘變試劑 ENU和DMBA作為陽性劑進行比較。ENU導致 SD大鼠 Pig-a基因突變發(fā)生率高于 DMBA，在

8、后續(xù)的實驗中均選擇 ENU作為陽性對照。
　　2）實驗分別在末次給藥后第1、2、4、5和8周進行流式細胞儀檢測，檢測結果在末次給藥后第4周的檢測值接近峰值，在后續(xù)的實驗中選擇末次給藥后1、2、4周進行檢測。
　　3）實驗選取5周齡和9周齡的SD大鼠進行實驗比較，結果證實選用5周齡的大鼠檢測得到的Pig-a基因突變率高于9周齡 SD大鼠，在后續(xù)的實驗中選擇5周齡大鼠作為實驗動物。實驗對正常 SD大鼠進行背景值檢測，正常 SD大

9、鼠的自發(fā)RBCCD59-發(fā)生率為12~95×10-6，為后續(xù)實驗提供背景數(shù)據(jù)
　　4）方法學驗證：①在檢測細胞數(shù)一定的前提下，樣本中所含的被檢目標細胞數(shù)越多，檢測差異性越小。②染色細胞穩(wěn)定性：樣本制備完成后，在暗處的放置時間不超過3.5小時，檢測結果不會出現(xiàn)統(tǒng)計學差異。③血樣穩(wěn)定性：抗凝血樣放置冰箱不超過1小時內(nèi)，同放置時間為8小時和24小時的血樣檢測結果相比，8小時和24小時的血樣檢測值升高，抗凝血樣放置時間將影響檢測結果的準確

10、性。④流式細胞儀檢測準確性分析：當被檢目標細胞數(shù)在一定的數(shù)量時，流式細胞儀檢測值同期望值之間有很高的一致性。⑤檢測細胞數(shù)目：當檢測細胞數(shù)為100 萬時重復檢測結果存在的差異性最小，在實驗條件允許的情況下，盡可能的選擇檢測數(shù)量多的細胞數(shù)。
　　5）方法應用：①順鉑注射液：對順鉑組實驗動物進行血液涂片觀察，發(fā)現(xiàn)其血細胞的形態(tài)發(fā)生很大變化，對于依靠形狀大小檢測來區(qū)分細胞團的流式檢測方法，對其檢測結果有一定的影響。在已獲得的數(shù)據(jù)中，沒有發(fā)