基因突變的檢測(cè)方法

1、基因突變的檢測(cè)方法基因突變的檢測(cè)方法基因突變的研已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，檢測(cè)方法也隨之迅速發(fā)展。人類細(xì)胞癌基因的突變類型已如上所述，對(duì)于基因突變的檢測(cè)，1985以前，利用Southern印跡法，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。對(duì)于用該法法不能檢測(cè)的突變，只能應(yīng)用復(fù)雜費(fèi)時(shí)的DNA序列測(cè)定分析法。多聚酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreactionPCR）技術(shù)是突變研究中的最重大進(jìn)展，使基因突變檢測(cè)技術(shù)有了

2、長(zhǎng)足的發(fā)展，目前幾乎所有的基因突變檢測(cè)的分子診斷技術(shù)都是建立于PCR的基礎(chǔ)之上，并且由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，目前已達(dá)二十余種，自動(dòng)化程度也愈來愈高，分析時(shí)間大大縮短，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也有很大很提高。其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrcomfmationalpolymphismSSCP）和異源雙鏈分析法（heteroduplexanalysisHA）。下面分別介紹幾種PCR衍生技術(shù)及經(jīng)典突變檢測(cè)方法，可根據(jù)檢測(cè)目的和實(shí)驗(yàn)室

3、條件選擇時(shí)參考。PCRSSCP法PCRSSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構(gòu)象，一個(gè)堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上的移動(dòng)速度改變。其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成，即使一個(gè)堿基的不同，也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)而出刺同的遷移率。由于該法簡(jiǎn)單快速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測(cè)。用PCRSSCP法檢測(cè)小于200bp的PCR產(chǎn)物時(shí)，突

4、變檢出率可達(dá)70％95％，片段大于400bp時(shí)，檢出率僅為50％左右，該法可能會(huì)存在1％的假陽(yáng)性率。應(yīng)用PCRSSCP法應(yīng)注意電泳的最佳條件，一般突變類型對(duì)檢測(cè)的靈敏度無大的影響，同時(shí)該法不能測(cè)定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)，還需通過序列分析來確定。Sarkar等認(rèn)為對(duì)于大于200bp的片段，用其RNA分子來做SSCP會(huì)提高其錄敏度。應(yīng)用PCRSSCP檢測(cè)點(diǎn)突變已見報(bào)道于人類大部分的腫瘤組織或細(xì)胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。檢測(cè)的

5、基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測(cè)抑癌基因p53突變最常用的方法，僅檢測(cè)第58外顯子即可發(fā)現(xiàn)85％以上的p53基因突變。由于該法簡(jiǎn)便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。異源雙鏈分析法（HA）HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯(cuò)配處會(huì)形成一突起，在非變性凝膠中電泳時(shí)，會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似，所不同的是SSCP分離的是單

6、鏈DNA，HA法分離的是雙鏈DNA，也只適合于小片段的分析。但HA對(duì)一些不能用SSCP檢出的突變有互補(bǔ)作用，兩者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高到近100％。突變體富集PCR法（mutantenrichedPCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某個(gè)密碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，如Kras基因第12密碼子的BstNI位點(diǎn)，第13密古巴子有BgⅠⅡ位點(diǎn)。用鏈續(xù)二次的巢式PCR來擴(kuò)增包括Kras第12、13密碼子的DNA片段，在兩次擴(kuò)

7、增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集。擴(kuò)增。LCR產(chǎn)物檢測(cè)最初是通過這32p標(biāo)記上游引物3`未端，經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自顯影加以鑒定，其檢測(cè)敏感性達(dá)到200個(gè)靶分子。也可設(shè)計(jì)1個(gè)橫跨兩引物的檢測(cè)探針，用它與LCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測(cè)。近年有應(yīng)用熒光素、地高辛等非核素標(biāo)記方法。Batt在1994年發(fā)展了一種更為簡(jiǎn)的方法，好微孔板夾心雜交

8、法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能檢測(cè)單個(gè)堿基突變的能力，因此被應(yīng)用于腫瘤基因突變的分子診斷，并與PCR結(jié)合用以提高其敏感性。等位基因特異性擴(kuò)增法（AllelespecificamplificationASA）ASA于1989年建立，是PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（amplificationrefractymutationsystemARMS）、等位基因特性PCR（allelespecificPCRASPCR）

9、等，用于對(duì)已知突變基因進(jìn)行檢測(cè)。該法通過設(shè)計(jì)兩個(gè)5`端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)，對(duì)于純合性突變，分別加入這兩種引物及3`端引物進(jìn)行兩個(gè)平行PCR，吸有與突變DNA完互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯(cuò)配位于引物的3`端則導(dǎo)致PCR不能延伸，則稱為ARMS。ARMS和ASPCR借鑒多重PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同時(shí)檢測(cè)兩種或多種等位基因突變位點(diǎn)。ASA法的檢出率依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化和可能發(fā)生的引物與靶DN

10、A有氏配時(shí)錯(cuò)配延伸，特別是當(dāng)錯(cuò)配堿基為G：T時(shí)，這時(shí)可通過調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件如引物靶DNA，TaqDNA聚合酶的濃度等來得高瓜在特異性。在反應(yīng)體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴(kuò)增。還可通過在引物3`端的第二個(gè)堿基引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，使之與模板之間形成雙重錯(cuò)配以阻止錯(cuò)誤延伸。RNA酶A切割法（RNaseAcleavage）在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的錯(cuò)配堿基可被RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離

11、。當(dāng)RNA探針上錯(cuò)配的堿基為嘌呤時(shí)，RNaseA在錯(cuò)配處的切割效率很低，甚至不切割，而當(dāng)錯(cuò)配堿基為嘧啶時(shí)，則其切割效率較高。故如果僅分析被檢DNA的一個(gè)條鏈，突變檢出率只有30％，如同時(shí)分析正義和反義二條鏈，檢出率可達(dá)70％。該法需要制備RNA探針，增加了操作的復(fù)雜性，但可用于12kb的大片段進(jìn)行檢測(cè)，并能確定突變位點(diǎn)。于這些優(yōu)越性，它仍被作為一種經(jīng)典方法用于對(duì)未知突變進(jìn)行分析。染色體原位雜交（Insituhybridizationof

12、chromosome）染色體發(fā)現(xiàn)距今已有150多年的歷史，染色體檢測(cè)被廣泛用于動(dòng)、植物及人類的細(xì)胞遺傳學(xué)研究，隨著染色體分技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展。染色體研究范圍也不斷擴(kuò)大，特別是用于腫瘤分子診斷。腫瘤細(xì)胞的染色體變化是一非常普遍的現(xiàn)象，可分為原發(fā)和繼發(fā)兩類。在腫瘤形成的生物學(xué)基礎(chǔ)方面，原發(fā)性的染色體變化與引起腫瘤的直接原因有關(guān)，腫瘤細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)各種形式的染色體畸變，如缺失、重復(fù)、易位、重排、單體斷裂及核內(nèi)復(fù)制等；繼發(fā)性變化主要是腫

13、瘤細(xì)胞核型的改變。染色體的檢測(cè)對(duì)于腫瘤的診斷、鑒別診斷、生物學(xué)行為判別等方面都重要意義。染色體的檢測(cè)方法進(jìn)展很快，檢測(cè)的精確率也不斷提高，這里主要介紹熒光原位雜交和PRINS法。熒光原位雜交技術(shù)（fluescentinsituhybridiaationFISH）創(chuàng)建于1986年。1969年Gall和Pardue首先應(yīng)用核素標(biāo)記核苷酸制備探針，通過放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)。應(yīng)用核素標(biāo)記的探針其敏感性可以檢測(cè)到中期染色體上幾百堿基的單拷貝靶核