聚合酶鏈反應(yīng)及基因突變檢測方法

1、聚合酶鏈反應(yīng)及基因突變檢測方法,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉湘帆 講師,,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)于1983年由美國Cetus公司的K.Mullis建立，并和定點突變的發(fā)明者M.Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究開創(chuàng)了嶄新時代。,PCR反應(yīng)的特點,特異性強 引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實性 靈敏度高 指數(shù)增長，從pg (10-12)可擴增至 mg (10-6)水平 簡便、快速 2～4

2、小時完成擴增對標(biāo)本的純度要求低 DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板,一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過程,DNA的體外復(fù)制包括3個步驟：變性（denaturation）:94 ?C ~95 ?C 退火（annealing）:40 ?C ~70 ?C 延伸（extension）:72 ?C 3個步驟作為PCR的一個循環(huán)，每當(dāng)完成一個循環(huán)，一個分子的模板被復(fù)制為二個，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長。,PCR原理,d.N

3、TPs,耐熱DNA聚合酶,引物,添加反應(yīng)混合液及樣本,,變性,,退火,加入試管中,,,延伸,繼續(xù)延伸,,循環(huán),PCR原理,第二個循環(huán)4個拷貝,第三個循環(huán)8個拷貝,,,第n個循環(huán)2n個拷貝,PCR原理,The Polymerase Chain Reaction (PCR),18,,,,20-30X,,,,,94 ?C(30 s),,,40-60 ?C(30 s),,,,,,,,,,,,72 ?C(30-60 s/kb),,,

4、,Melt,Anneal,Extend,Cycle #2,NIH,,,,20-30X,,,,,二、PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,（一）PCR反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和緩沖液等。,1 模板,包括基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA等 模板DNA需較高的濃度 RNA作為模板時，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以 cDNA作為擴增的模板 模板量

5、：1000ng、500ng、100ng、50ng?,2、引 物（Primers),引物決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度，是化學(xué)合成的寡核苷酸片段化學(xué)合成的寡核苷酸能與模板特異地結(jié)合引物決定產(chǎn)物的特異性和長度引物設(shè)計時必須遵循一些原則,設(shè)計引物的原則：,二條引物分別位于被擴增片段的兩端，與模板正負(fù)鏈序列互補長度為18 ~ 25個核苷酸二條引物之間避免形成引物二聚體引物的堿基組成應(yīng)平衡引物退火溫度計算：Tm=2（A+T）

6、+4（C+G）引物的5`端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位點、生物素等標(biāo)記）,引物濃度：0.1 ~ 0.2umol/L,濃度過高容易生成引物二聚體,3、脫氧核苷三磷酸（dNTP）,是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧 核苷三磷酸的混合物 反應(yīng)體系中各種核苷酸的濃度必須一致 濃度過高雖能加快反應(yīng)速度，但非特異 性擴增也隨之增加 dNTP濃度：20 ~ 200umol/L,濃度升高增加非特異性擴增,

7、4、DNA聚合酶,從一種生活在熱泉（80℃~90℃）中的水棲 噬熱菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取， 有很高的耐熱穩(wěn)定性 Taq 酶的作用: 模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，在引物3’-OH末端加上脫氧單核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。 最適酶量：1-2.5U （酶量過多，導(dǎo)致非特異性擴增）,,Taq DNA聚合酶復(fù)制的保真性：Ta

8、q DNA聚合酶無3’ → 5’外切酶活性，因而無校正功能，在復(fù)制新鏈的過程中會發(fā)生堿基錯配。Taq DNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000，故擴增的片段越長，錯配的機率越高。,,耐熱的 DNA多聚酶：Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有較高的熱穩(wěn)定性，較高的保真性，降低堿基錯配率2 ~ 10倍。,5、鎂離子濃

9、度,鎂離子濃度是一個至為關(guān)鍵的因素，對于反應(yīng) 系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影響 雖然Taq 酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關(guān)， 但PCR反應(yīng)體系中dNTP、引物、模板DNA及 鰲合劑的存在均可與Mg2+結(jié)合而降低游離 Mg2+的濃度從而影響酶的活性。 當(dāng)dNTP濃度為200umol/L時，MgCl2的濃度為1.5mmol/L較宜。,6、其它反應(yīng)因素,pH：調(diào)節(jié)至酶反應(yīng)所需

10、的最適pH（ pH =7.2左右）鹽：合適的鹽濃度有利于穩(wěn)定雜交體，有利于引物與模板雜交基質(zhì)：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明膠等基質(zhì)可以保護Taq 酶的活性）,（二）PCR的反應(yīng)條件,反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)時間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）,1、溫度,變性溫度：94 ~ 97 ℃ 退火溫度：低于引物Tm 5 ℃左右 溫度過

11、高：降低擴增效率； 溫度過低：增加非特異性擴增 延伸溫度：72度，此時Taq酶具有較高的酶 促活性,2、時間,第一次變性應(yīng)給予足夠時間（5 ~ 7分鐘） 每一個步驟所需時間取決于擴增片段的長度，一般為30秒~ 1分鐘，時間過長易導(dǎo)致非特異性擴增,3、循環(huán)次數(shù),重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為25～35個循環(huán)擴增反應(yīng)的平臺效應(yīng)： 理論上，PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長，但這種

12、增長形式在擴增25-25個循環(huán)以后便放慢直至停止，達到反應(yīng)平臺，此時擴增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長,指數(shù)增長期線形增長期平臺期,循環(huán)數(shù) #,PCR過程的實時監(jiān)測,,平臺出現(xiàn)得遲早與模板的初始量有關(guān)，模板初始量越多，平臺出現(xiàn)得越早。平臺效應(yīng)產(chǎn)生的因素： 引物二聚體的產(chǎn)生、反應(yīng)產(chǎn)物、各組分的消耗和變性、引物和已擴增的DNA片段間的競爭等,三、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制,（一）實驗室的規(guī)范化設(shè)置實驗室的規(guī)范化設(shè)置：

13、 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 標(biāo)本制備區(qū) 擴增反應(yīng)區(qū) 產(chǎn)物分析區(qū) PCR技術(shù)的質(zhì)量保證： 基因擴增檢驗的全過程的質(zhì)量保證 室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價 PCR實驗系統(tǒng)中的污染源及防污染措施,,防污染體系：正確設(shè)置實驗室、嚴(yán)格規(guī)范實驗操作、完整有效的去污染措施、反應(yīng)體系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破壞以往的擴增產(chǎn)物、人員培訓(xùn)、試

14、劑質(zhì)量,,（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證 分析前因素：標(biāo)本采集、運送、穩(wěn)定化處理、貯存 分析中因素：核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴增反應(yīng)、設(shè)置 對照系統(tǒng)（包括陰性對照、陽性對照、內(nèi)對照等） 分析后因素：報告形式、反饋的信息等,第二節(jié) 以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù),,以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù),逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)定量PCR (quantitative PCR )

15、多重PCR (multiplex PCR) 免疫PCR差異顯示PCR (differential display PCR, DD-PCR)PCR誘導(dǎo)定點突變原位PCR (in situ PCR),一、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）,以細胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進行體外擴增的技術(shù)。主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探針，檢測RNA病毒、分析基因表達等,,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA方式：以隨機進行的PCR擴增所需的下游引物作為逆轉(zhuǎn)

16、錄反應(yīng)的引物以oligo(dT)作為引物， mRNA3`末端polyA尾與之互補以人工合成的隨機序列六核苷酸混合物作為引物，進行擴增,二、定量PCR,對DNA或RNA樣本的靶序列進行定量分析。主要用于基因表達的分析、病原體核酸的檢測等在定量PCR反應(yīng)體系中，除了常規(guī)PCR反應(yīng)所需的材料和試劑外，還必須引入內(nèi)參照系統(tǒng)。內(nèi)參照系統(tǒng)一般選用與待測序列結(jié)構(gòu)無關(guān)的基因常用的內(nèi)參照基因是?-肌球蛋白基因,,絕對定量 PCR外參照系統(tǒng)的

17、設(shè)置內(nèi)參照系統(tǒng)的設(shè)置,實時定量 PCR 對核酸擴增反應(yīng)進行直接和動態(tài)的監(jiān)測， 實現(xiàn)對靶基因的實時定量分析,,熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又稱實時PCR，是目前較精確的進行定量檢測PCR的方法FQ-PCR通過熒光信號對PCR過程中產(chǎn)物量進行實時監(jiān)測，精確計算出PCR的初始模板量,,熒光信號的檢測方法：1、DNA結(jié)合染料技術(shù)2、水解探針技術(shù)（TaqMan

18、 probe）技術(shù)3、雜交探針技術(shù),TaqManTM,d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase,Primers,Add Master Mix and Sample,Denaturation,,Annealing,Reaction Tube,l,,TaqManTM,,Extension Step,1. Strand Displacement,2. Cleavage,3. Polymerization

19、Complete,4. Detection,l,,,,實時定量RT-PCR檢測CEA基因拷貝數(shù)在監(jiān)測胃腸癌微轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用,,CEA 基因在消化系統(tǒng)上皮腺癌， 尤其是直結(jié)腸癌和胃癌中高表達， 因此在腫瘤細胞內(nèi)可檢測到其轉(zhuǎn) 錄本，而在正常成人體內(nèi)極少表 達。,正常成人體內(nèi)CEA基因表達,,胃腸癌腫瘤組織中CEA基因的表達,在腫瘤發(fā)生血道轉(zhuǎn)移時，外周血 中有少量腫瘤細胞殘留。用靈敏、

20、特異的技術(shù)檢測到這些腫瘤細胞 中CEA基因的轉(zhuǎn)錄本，是發(fā)現(xiàn)腫 瘤早期轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。,胃腸癌患者外周血中CEA基因的表達,三、多重PCR,在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，同時擴增一份DNA樣本中多個不同序列的靶片段。,DMD基因外顯子缺失的檢測,四、差異顯示PCR（differential display PCR,DD-PCR）,一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達差異的技術(shù)。DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳

21、學(xué)研究，是目前篩選基因表達差異最有效的方法。,差異顯示RT-PCR(Differential display RT-PCR),第三節(jié) 點突變的檢測技術(shù),,,PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP） 等位基因特異性寡核苷酸 （allele specific oligonucleotide, ASO）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism, SSCP）

22、 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 融點曲線分析（melting curve analysis）PCR產(chǎn)物的序列分析,點突變,一、 已知點突變的檢測方法 1.PCR-RFLP 利用正常序列或突變序列是否處于限制性內(nèi)切酶的酶切位點而設(shè)計。若點突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點內(nèi)，可在突變點兩側(cè)設(shè)計引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序列。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進行水解并作電泳分離，可根據(jù)水解片段的大小和電

23、泳位置區(qū)分二者。,Bcl I RFLP（血友病A）,2.等位基因特異性寡核苷酸雜交,被檢基因經(jīng)PCR擴增后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與長度為15~20bp、經(jīng)標(biāo)記的正常序列和突變序列的寡核苷酸探針雜交。由于20個堿基中僅一個堿基差異即可使DNA分子的Tm值下降 5~7.5℃，因此通過嚴(yán)格控制雜交條件，可使PCR產(chǎn)物僅與完全互補的探針雜交，根據(jù)有無雜交信號即可判斷被檢者的擴增片段中是否帶有突變點。,3.DNA芯片技術(shù)（DNA chip）,在固相支

24、持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龍膜等）表面有序地陣列一系列固定于一定位置的分子（探針），當(dāng)標(biāo)記樣品（如用化學(xué)熒光法、化學(xué)發(fā)光法標(biāo)記）與探針進行雜交后，用共聚焦熒光自動掃描等技術(shù)獲取信息，經(jīng)計算機系統(tǒng)處理、分析后得到結(jié)果。,s,4. Southern印跡雜交,二、未知點突變的檢測方法,1. 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformational polymorphism，SSCP） 突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)

25、變性后產(chǎn)生兩條與正常 DNA構(gòu)象不同的單鏈，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳時，不同構(gòu)象的片段顯示不同的電泳遷移率，從 而能區(qū)別正常與突變的DNA。SSCP只適用于檢測 150~200bp長度的DNA片段。,2. 變性梯度凝膠電泳（DGGE）,利用不同序列的DNA分子具有不同的融點溫度(Tm)的特性。設(shè)計引物時使被擴增的目的片段含有2個不同的區(qū)域，一個Tm較高，另一個較低，將該PCR產(chǎn)物在由變性劑形成的梯度凝膠上進行

26、電泳，由于正常序列的PCR產(chǎn)物與突變的 PCR 產(chǎn)物的Tm不同，在電泳過程中Tm較低的區(qū)域被部分解鏈的先后不同，造成電泳遷移率的變化也不同，最后在凝膠中所處的電泳位置也不同，據(jù)此可以區(qū)別正常片段與突變片段。,3.異源雙鏈分析（heteroduplex analysis，HA）,正常DNA和突變DNA在一起變性后再緩慢復(fù)性，可使兩者互補形成異源雜合雙鏈，并在錯配處形成一個凸起。在非變性凝膠電泳時，異源雙鏈片段會產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈片段不

27、同的遷移率，從而使二者分開。,4. 熔點曲線分析(melting curve analysis）,DNA片段中突變堿基與正常堿基不能配對而形成異源雙鏈，所產(chǎn)生的Tm較完全配對的同源雙鏈的Tm低，在儀器上顯示出不同的曲線從而將突變序列檢測出來。所需儀器如高效液相色譜儀(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系統(tǒng)、LightCycler等。,5.DNA序列分析（DNA sequencing）,Sanger測序技術(shù)： 以待測序列的單鏈

28、DNA作為模板，加入一個引物和dNTP作為底物，并加入一定比例的2’，3’-ddNTP，在DNA聚合酶的作用過程中，正常dNTP的摻入使鏈延伸，若ddNTP的摻入則使鏈終止，這樣就可以得到一系列長度不同的以四種ddNTP結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)電泳后可直接讀出堿基序列。,PCR測序演示版,,,1,2,第四節(jié) PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用,,PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用,感染性疾病中病原微生物核酸的檢測單基因遺傳性疾病的基因診斷多基因病相