高保真DNA聚合酶分子開關(guān)在EGFR基因突變檢測中的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　針對五種可指導非小細胞肺癌臨床個體化用藥的相關(guān)EGFR突變基因，建立由高保真DNA聚合酶介導的突變敏感性分子開關(guān)技術(shù)平臺，并結(jié)合多重PCR，熒光定量PCR等診斷技術(shù)，研發(fā)出一種快速，靈敏，廉價的EGFR基因診斷方法，以指肺癌的個體化治療。
　　方法：
　　相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，酪氨酸激酶抑制劑（TKI）（如吉非替尼，厄酪替尼）等肺癌治療藥物的療效在很大程度上由酪氨酸激酶的編碼區(qū)基因突變與否決定。其中，最為重要的

2、突變包括第19外顯子15個堿基缺失，18個堿基缺失，L858R突變，S768I突變，以及獲得性突變T790M。
　　本研究將含有EGFR突變的基因和野生基因，運用PCR等技術(shù)，亞克隆于質(zhì)粒載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)化鋪板以及質(zhì)粒提取和擴增等一系列的步驟來獲得含有EGFR載體，之后再根據(jù)構(gòu)建好的載體來制備突變和野生的EGFR模板。根據(jù)EGFR相關(guān)序列，針對S768I,T790M,L858R，15-bp和18-bp缺失5個突變位點，設(shè)計相應(yīng)的分子開

3、關(guān)引物（通過硫化磷酸化修飾，使之與突變模板完全吻合；而不完全與野生模板相吻合，具有針對突變的特異性）來構(gòu)成檢測EGFR突變的特異性體系。并且將該體系結(jié)合多重PCR，熒光定量PCR等相關(guān)技術(shù)，檢測肺癌患者的腫瘤樣本，也可進一步對血液中游離DNA進行嘗試檢測。
　　結(jié)果：
　　本課題成功研發(fā)出針對五種EGFR突變基因的分子開關(guān)突變檢測系統(tǒng)。該突變檢測系統(tǒng)具有較高的靈敏性何特異性。對于與硫化修飾引物完全配對的突變模板其檢測的靈敏性

4、達到10到100個拷貝，而對于與硫化修飾引物不完全配對的野生在模板濃度高于106個拷貝時候才出現(xiàn)擴增，因此其特異性可達到106至107。當熒光定量PCR以及多重PCR利用此體系來檢測，它們得到的結(jié)果與普通PCR較為一致。在僅有萬分之一突變模板濃度（突變模板：野生模板=1:10000）下，該體系仍能檢測到突變的存在。最為重要的是，運用該體系檢測20例肺癌樣本，成功檢測出L858R突變患者兩例，經(jīng)測序驗證結(jié)果正確，表明該檢測平臺完全可以應(yīng)用