高保真DNA聚合酶分子開(kāi)關(guān)在EGFR基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　針對(duì)五種可指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌臨床個(gè)體化用藥的相關(guān)EGFR突變基因，建立由高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開(kāi)關(guān)技術(shù)平臺(tái)，并結(jié)合多重PCR，熒光定量PCR等診斷技術(shù)，研發(fā)出一種快速，靈敏，廉價(jià)的EGFR基因診斷方法，以指肺癌的個(gè)體化治療。
　　方法：
　　相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，酪氨酸激酶抑制劑（TKI）（如吉非替尼，厄酪替尼）等肺癌治療藥物的療效在很大程度上由酪氨酸激酶的編碼區(qū)基因突變與否決定。其中，最為重要的

2、突變包括第19外顯子15個(gè)堿基缺失，18個(gè)堿基缺失，L858R突變，S768I突變，以及獲得性突變T790M。
　　本研究將含有EGFR突變的基因和野生基因，運(yùn)用PCR等技術(shù)，亞克隆于質(zhì)粒載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)化鋪板以及質(zhì)粒提取和擴(kuò)增等一系列的步驟來(lái)獲得含有EGFR載體，之后再根據(jù)構(gòu)建好的載體來(lái)制備突變和野生的EGFR模板。根據(jù)EGFR相關(guān)序列，針對(duì)S768I,T790M,L858R，15-bp和18-bp缺失5個(gè)突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的分子開(kāi)

3、關(guān)引物（通過(guò)硫化磷酸化修飾，使之與突變模板完全吻合；而不完全與野生模板相吻合，具有針對(duì)突變的特異性）來(lái)構(gòu)成檢測(cè)EGFR突變的特異性體系。并且將該體系結(jié)合多重PCR，熒光定量PCR等相關(guān)技術(shù)，檢測(cè)肺癌患者的腫瘤樣本，也可進(jìn)一步對(duì)血液中游離DNA進(jìn)行嘗試檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　本課題成功研發(fā)出針對(duì)五種EGFR突變基因的分子開(kāi)關(guān)突變檢測(cè)系統(tǒng)。該突變檢測(cè)系統(tǒng)具有較高的靈敏性何特異性。對(duì)于與硫化修飾引物完全配對(duì)的突變模板其檢測(cè)的靈敏性

4、達(dá)到10到100個(gè)拷貝，而對(duì)于與硫化修飾引物不完全配對(duì)的野生在模板濃度高于106個(gè)拷貝時(shí)候才出現(xiàn)擴(kuò)增，因此其特異性可達(dá)到106至107。當(dāng)熒光定量PCR以及多重PCR利用此體系來(lái)檢測(cè)，它們得到的結(jié)果與普通PCR較為一致。在僅有萬(wàn)分之一突變模板濃度（突變模板：野生模板=1:10000）下，該體系仍能檢測(cè)到突變的存在。最為重要的是，運(yùn)用該體系檢測(cè)20例肺癌樣本，成功檢測(cè)出L858R突變患者兩例，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確，表明該檢測(cè)平臺(tái)完全可以應(yīng)用