交鏈孢霉酚誘導(dǎo)細(xì)胞DNA聚合酶β基因突變及表達(dá)的分析.pdf

1、背景與目的 霉菌毒素在腫瘤病因?qū)W上的作用已經(jīng)被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)同。研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)的霉菌毒素主要在基因水平導(dǎo)致基因突變而致癌。其中交鏈孢霉酚(Alternariol，AOH)和交鏈孢酚單甲醚(A1ternari-oimonomtyhiether，AME)已證明具有強(qiáng)的致癌性[2]。而DNA聚合酶β(polymerasepolβ)是DNA聚合酶家族中的一員，在DNA損傷修復(fù)中起著重要的作用，它主要對(duì)卜4個(gè)堿基突變進(jìn)行堿基切除修復(fù)(base

2、excisionrepair，BER)。已經(jīng)證實(shí)在多種腫瘤中DNApolβ的表達(dá)是增高的，且有多種形式的堿基突變。然而霉菌毒素的致癌機(jī)制與polβ是否有一定的關(guān)系，國內(nèi)外還沒有相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)將野生型poiB及空載體分別轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞，分別獲得穩(wěn)定表達(dá)野生型polB及空載體的NIH3T3細(xì)胞株；用不同濃度的AOH誘導(dǎo)這些細(xì)胞，觀察AOH對(duì)polβ的致突變作用及其對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響。為霉菌毒素致病機(jī)制的分子水平研究也為poiβ在

3、基因治療方面的研究提供重要依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1．細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染及AOH誘導(dǎo) 1．1從DH5α細(xì)菌中提取質(zhì)粒pEGFP—C3、pEGFP—C3一polβ。 1．2將質(zhì)粒用脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞；G418篩選2周；得到穩(wěn)定高表達(dá)轉(zhuǎn)染野生型p01B和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的NIH3T3細(xì)胞株。 1．3藥物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染pEGFP—C3一polB的N’[H3T3細(xì)胞、pEGFP—C3的NIH3T3細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的NI

4、H3T3細(xì)胞48小時(shí)。 2．提取mRNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，擴(kuò)增出polβ全基因，插入T載體，進(jìn)行DNA序列測(cè)定，并利用DNASIS軟件分析發(fā)現(xiàn)突變位置和形式，推測(cè)突變對(duì)氨基酸的改變和對(duì)polB蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。 3．半定量RT-PCR測(cè)定po]B基因表達(dá)量的變化。 4．提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行雙向電泳。并用PDQuest7．1．1凝膠圖像分析軟件分析電泳結(jié)果，比較三個(gè)樣本的電泳圖譜，尋找差異表達(dá)蛋白

5、。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pEGFP-C3的NIH3T3細(xì)胞DNApolB基因突變點(diǎn)個(gè)數(shù)隨AOH濃度升高增多，而轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-polB的NIH3T3細(xì)胞DNApolβ基因在L5μmol／L和2．0μmol／L的AOH濃度誘導(dǎo)下未見突變發(fā)生，當(dāng)AOH濃度增大到2．5umol／L才出現(xiàn)DNApolβ基因突變。 2．未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pEGFP-C3的NIH3T3細(xì)胞在1．5u

6、mol／L濃度的AOH誘導(dǎo)下，74位A—G，導(dǎo)致氨基酸由天冬酰胺變?yōu)樘於彼幔?57位A—T，導(dǎo)致氨基酸由賴氨酸變?yōu)楫惲涟彼?；?．0umol幾濃度的AOH誘導(dǎo)下，208位A—G，未造成氨基酸改變，250位T—C，未造成氨基酸改變，372位C—T，導(dǎo)致氨基酸由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸；在2．5μm01／L濃度的AOH誘導(dǎo)下，332位A—G，導(dǎo)致氨基酸由天冬酰胺變?yōu)樘於彼幔?23位A—G，導(dǎo)致氨基酸由天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸，433位A—G，未造成氨

7、基酸改變，851位T—C，導(dǎo)致氨基酸由酪氨酸變?yōu)榻M氨酸。而轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-polB的NIH3T3細(xì)胞在1．5umol／L和2．Oμmol／L濃度的AOH誘導(dǎo)下未見突變發(fā)生；當(dāng)其AOH濃度增加為2．5umol／L時(shí)有突變發(fā)生，84位T—C，導(dǎo)致氨基酸由異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸，¨3位T—C，導(dǎo)致氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼幔?76位T—C，導(dǎo)致氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼幔?70位A—G，導(dǎo)致氨基酸由賴氨酸變?yōu)楦拾彼帷?3．在AOH誘

8、導(dǎo)下，三種細(xì)胞polB表達(dá)量都有升高的現(xiàn)象，且隨AOH濃度升高而升高；但在同樣濃度的AOH誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染野生型的polβ的NIH3T3細(xì)胞的poiB升高的程度較未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的NIH3T3細(xì)胞的表達(dá)量升高程度低(P

9、組有pH約4．3，分子量約40kD和洲約5．2，分子量約15kD的差異蛋白表達(dá)。 結(jié)論 1．一定濃度的AOH誘導(dǎo)可導(dǎo)致DNApolβ的突變，可以使NIH3T3細(xì)胞polB表達(dá)量增高。提示食管癌的霉菌毒素病因的分子機(jī)制，可能與其使DNApolβ喪失或降低修復(fù)活性有關(guān)。2．轉(zhuǎn)染野生型DNApolB能夠一定程度抵抗AOH對(duì)NIH3T3細(xì)胞的致突變作用。polB抵抗AOH致突變作用的臨界濃度可能是2．5μmol／L。 3