DNA聚合酶β、GST-π基因表達(dá)的調(diào)控對(duì)食管癌細(xì)胞耐藥性的作用.pdf

1、食管癌是中國(guó)(尤其河南省林州市及輝縣)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，該地區(qū)食管癌的發(fā)病率、死亡率均極高。化療是食管癌主要的臨床治療手段之一，然而腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)現(xiàn)象的產(chǎn)生常影響化療藥物的療效，MDR是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因，資料表明，90％以上腫瘤患者的死因與MDR有關(guān)。MDR指的是腫瘤細(xì)胞在接觸某一種化療藥物后，不僅對(duì)此種藥物產(chǎn)生耐受性，而且對(duì)其它的結(jié)構(gòu)和功能不同的多種藥物也產(chǎn)生交叉耐受

2、性。MDR是惡性腫瘤難治和復(fù)發(fā)的重要原因之一，是腫瘤細(xì)胞在生存壓力之下建立起來(lái)的一種適應(yīng)過(guò)程。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制產(chǎn)生MDR，如細(xì)胞膜上表達(dá)的藥物排流泵通過(guò)泵機(jī)制把藥物從細(xì)胞內(nèi)排出細(xì)胞外、細(xì)胞解毒能力的增強(qiáng)(如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST-π)、DNA修復(fù)能力的增強(qiáng)(如DNA聚合酶β)、藥物靶蛋白(如拓?fù)洚悩?gòu)酶TopoⅡ)量或活性的改變、蛋白激酶C各種同工酶活性和表達(dá)水平的改變等。不同腫瘤細(xì)胞可通過(guò)不同的途徑導(dǎo)致MDR的發(fā)生，一種腫瘤細(xì)胞可

3、同時(shí)存在多種耐藥機(jī)制。 因此體外建立食管癌耐藥細(xì)胞系，篩查食管癌耐藥相關(guān)基因，從基因表達(dá)水平尋找在耐藥產(chǎn)生中具有關(guān)鍵作用的分子改變，對(duì)于全面了解腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制，尋找逆轉(zhuǎn)藥物耐受的分子靶點(diǎn)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。 本研究首先用食管癌細(xì)胞EC9706作為親本細(xì)胞誘導(dǎo)建立耐藥細(xì)胞系EC9706/cDDP。在此基礎(chǔ)上，用RT-PCR方法篩選食管癌耐藥相關(guān)基因，之后選取polβ、GST-π基因進(jìn)一步研究其與食管癌耐藥的相關(guān)性

4、。通過(guò)調(diào)控其表達(dá)水平觀察對(duì)食管癌細(xì)胞耐藥性的作用，即分別構(gòu)建這2個(gè)基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染入EC9706細(xì)胞，初步觀察其生物學(xué)效應(yīng)，尤其對(duì)耐藥指數(shù)的影響; 并構(gòu)建靶向這2個(gè)基因的siRNA重組慢病毒，探討其體外對(duì)食管癌細(xì)胞耐藥性逆轉(zhuǎn)的效果以及在裸鼠體內(nèi)逆轉(zhuǎn)移植瘤耐藥性的效果。 論文分4部分： 第一部分人食管鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞系EC9706/cDDP的建立及相關(guān)耐藥基因的篩選 方法：采用順鉑(cDDP)中等濃度、間歇

5、作用方法歷時(shí)9個(gè)月建立耐藥細(xì)胞系EC9706/cDDP，光學(xué)顯微鏡觀察耐藥細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；MTT法測(cè)定其對(duì)cDDP、5-FU、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇的敏感性，觀察凍存、撤藥對(duì)耐藥性的影響；比較耐藥與親本細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、群體倍增時(shí)間、貼壁率的不同；流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期；軟瓊脂實(shí)驗(yàn)測(cè)細(xì)胞的惡性增殖能力；羅丹明攝入/排出實(shí)驗(yàn)測(cè)定P-gp功能；RT-PCR半定量方法測(cè)定親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞耐藥相關(guān)基因如DNA聚合酶(polβ)、多藥耐藥相關(guān)基因(MRP

6、)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-π(GST-π)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topo Ⅱ)和多藥耐藥基因(mdrl)等基因的tuRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：人食管鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞系EC9706/cDDP在形態(tài)學(xué)上與親本細(xì)胞無(wú)明顯差別，但對(duì)cDDP的敏感性降低，耐藥指數(shù)為15.7，同時(shí)對(duì)未接觸過(guò)的5-FU、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇等有交叉耐藥性，耐藥指數(shù)分別為：3.2、2.8、1.8。凍存對(duì)耐藥性影響不大，撤藥培養(yǎng)可使細(xì)胞耐藥性降低，耐藥細(xì)

7、胞群體倍增時(shí)間延長(zhǎng)(29.79±0.48h vs 25.79±0.45h)，生長(zhǎng)緩慢，G0/G1、S期細(xì)胞比例增加，克隆形成率明顯高于親本細(xì)胞，二種細(xì)胞對(duì)羅丹明攝入/排出的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。polβ、DHFR、GST-π基因tuRNA的表達(dá)比親本細(xì)胞顯著增加(P<0.05)，TopoⅡ的表達(dá)降低(P<0.05)，而mdrl、MRP表達(dá)的增加無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 第二部分 polp、CST-π真核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

8、EC9706細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究 方法： 1．設(shè)計(jì)帶有接頭的GST-π全cDNA引物，提取EC9706細(xì)胞mRNA，RT-PCR擴(kuò)增出GST-π全基因，插入T載體，進(jìn)行序列分析，亞克隆入真核表達(dá)載體piRES2-AcGFP1中。 2．設(shè)計(jì)帶有接頭的polβ全cDNA引物，從野生型polβ的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-polβ中擴(kuò)增出polβ的放閱讀框序列，插入T載體，亞克隆入真核表達(dá)載體pIRES2-AcGFP1中

9、。 3．將構(gòu)建好的2種重組載體脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別導(dǎo)入EC9706細(xì)胞，G418篩選獲得分別穩(wěn)定高表達(dá)GST-π、polβ的EC9706細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)曲線測(cè)定，用半定量RT-PCR和Western-blot測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞GST-π、polβ的表達(dá)，MTT法測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化，雙層軟瓊脂試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞惡性程度。 結(jié)果： 1．分別構(gòu)建了GST-π真核表達(dá)載體(pIRES2-AeGFP1-GST-π)和pol

10、β真核表達(dá)載體(pIRES2-AcGFP1-pol β)。分別轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞后在熒光顯微鏡下可發(fā)出綠色熒光，經(jīng)篩選得到分別高表達(dá)GST-π、野生型polβ的EC9706細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯改變。 2．轉(zhuǎn)染pIRES2-AcGFP1-GST-π的細(xì)胞中GST-π mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(2.34±0.12)比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(0.94±0.14)明顯增加(P<0.05)。GST-π蛋白的相對(duì)表達(dá)水平比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯增加。

11、對(duì)eDDP的耐藥指數(shù)為2.36。 3．轉(zhuǎn)染pIRES2-AeGFPI-polβ的細(xì)胞中polβmNA的相對(duì)表達(dá)水平(1.21±0.15)比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(0.52±0.13)明顯增加(P<0.05)。polβ蛋白的相對(duì)表達(dá)水平比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯增加。對(duì)eDDP的耐藥指數(shù)為1.78。雙層軟瓊脂試驗(yàn)結(jié)果，EC9706-polβ細(xì)胞的集落生成率為57％，與EC9706(24％)及空質(zhì)粒對(duì)照EC9706-KC(26％)的集落生成率相比差異有統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 第三部分靶向GST-π、polβ的siRNA慢病毒的構(gòu)建及其對(duì)EC9706/cDDP細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn) 方法：設(shè)計(jì)分別靶向GST-π、polβ的編碼短發(fā)夾RNA的DNA單鏈模板各2對(duì)，退火后定向克隆入慢病毒載體pRNAT-U6.2/Lenti，PCR篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定得到靶向GST-π、polβ的siRNA慢病毒表達(dá)載體： GSTsil、GSTsi2、polsil、polsi2。用293FT

13、細(xì)胞包裝病毒，收集病毒液，以細(xì)胞GFP蛋白的表達(dá)水平測(cè)定病毒滴度。分別感染EC9706/eDDP細(xì)胞，RT-PCR、Western blot測(cè)感染細(xì)胞中GST-π、polβ的表達(dá)；MTT法測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化；免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察重組慢病毒的干擾效果。 第四部分裸鼠荷瘤試驗(yàn) 方法： 1．用EC9706和EC9706/cDDP細(xì)胞通過(guò)皮下注射的方法建立2種裸鼠移植瘤模型，觀察成瘤時(shí)間。當(dāng)移植瘤的直徑約5mm時(shí)，開(kāi)始

14、治療試驗(yàn)。 2．荷瘤裸鼠EC9706 4只，瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射cDDP(200μg/ml，0.1ml，每3天1次，連續(xù)4次)。 3.16只荷瘤裸鼠EC9706/cDDP，隨機(jī)分成4組：PBS組、cDDP(200μg/ml)組、cDDP+GSTsi2慢病毒組(200μg/ml cDDP與靶向GST-π的慢病毒液等量混勻)、cDDP+polsi1慢病毒組(200μg/ml cDDP與靶向polβ的慢病毒液等量混勻)。分別在瘤體內(nèi)

15、多點(diǎn)注射各0.1ml，每3天1次，連續(xù)4次，定期觀察腫瘤大小。 4．治療結(jié)束后處死各組裸鼠，取出移植瘤組織，測(cè)量體積。 結(jié)論： 1．建立了人食管鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞系EC9706/cDDP，且耐藥性穩(wěn)定，為耐藥機(jī)制及耐藥逆轉(zhuǎn)研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。其耐藥性的產(chǎn)生與polβ、GST-π、DHFR、TopoⅡ等基因的異常表達(dá)有較高相關(guān)性，而與mdr1、MRP表達(dá)的相關(guān)性不明顯； 2．GST-π表達(dá)的增加可導(dǎo)致食管癌細(xì)胞

16、對(duì)化療藥順鉑敏感性的降低；用RNAi技術(shù)沉默GST-π的表達(dá)可一定程度逆轉(zhuǎn)食管癌細(xì)胞的順鉑耐藥性； 3．polβ的表達(dá)增加可導(dǎo)致食管癌細(xì)胞對(duì)化療藥順鉑敏感性的降低及細(xì)胞惡性表型的增加；用RNAi技術(shù)沉默polβ的表達(dá)可一定程度逆轉(zhuǎn)食管癌細(xì)胞的順鉑耐藥性； 4．分別用EC9706和EC9706/cDDP構(gòu)建了荷瘤裸鼠，EC9706/cDDP具有較高的體內(nèi)順鉑耐藥性； 5．運(yùn)用靶向GST-π的高滴度重組慢病毒合并cD