細(xì)菌整合子捕獲與表達(dá)耐藥性基因盒調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、隨著抗生素的廣泛使用,細(xì)菌在抗生素的選擇壓力下,耐藥菌株不斷產(chǎn)生。其中通過基因的水平轉(zhuǎn)移,獲得外源性耐藥基因是加快臨床耐藥菌株產(chǎn)生與播散的重要原因。整合子通過位點(diǎn)特異性重組捕獲外源基因盒并使之表達(dá),同時(shí)整合子可位于質(zhì)粒上,或自身作為轉(zhuǎn)座子的一個(gè)組成部分而參與轉(zhuǎn)移,使耐藥基因發(fā)生播散。目前在整合子中發(fā)現(xiàn)的基因盒已超過80種,大部分是耐藥基因盒,編碼產(chǎn)物可賦予細(xì)菌對(duì)幾乎全部臨床常用藥物種類產(chǎn)生耐藥性,同一個(gè)整合子可變區(qū)可帶有多個(gè)耐藥基因盒,

2、使宿主菌對(duì)多種藥物產(chǎn)生耐藥性。整合子因其在細(xì)菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中的重要作用而受到研究者的關(guān)注。
　　有研究表明細(xì)菌在不利于其生長的環(huán)境中,可通過SOS反應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控整合酶蛋白的表達(dá),從而影響整合子捕獲基因盒的效率,同時(shí)到目前為止,整合酶蛋白催化的基因盒位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)體系在體外無法成功構(gòu)建,表明整合子捕獲與表達(dá)外源性基因盒存在著某種調(diào)控機(jī)制。由于整合子可變區(qū)基因盒中耐藥基因的表達(dá)關(guān)系到宿主細(xì)菌的耐藥表型,而整合子對(duì)耐藥性基因盒的捕

3、獲則關(guān)系到新耐藥菌株的產(chǎn)生與播散,因此對(duì)整合子捕獲與表達(dá)耐藥性基因盒的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,可加深對(duì)整合子這一細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境變化的進(jìn)化平臺(tái)的理解,進(jìn)而有可能開發(fā)出相關(guān)的藥物來下調(diào)或阻止整合子中耐藥基因盒的表達(dá),降低整合子對(duì)外源耐藥基因盒的捕獲頻率,從而減少耐藥菌株的產(chǎn)生與播散。
　　基于上述原因,本研究以第1類整合子作為研究對(duì)象,通過分子流行病學(xué)調(diào)查了解整合子在臨床菌株中的分布情況;由于位于質(zhì)粒上的基因盒的表達(dá)水平還與質(zhì)粒的拷貝數(shù)有

4、關(guān),本研究建立了一種快速確定第1類整合子是否位于質(zhì)粒上的方法;然后從整合子自身結(jié)構(gòu),主要是不同可變區(qū)啟動(dòng)子,對(duì)整合子捕獲與表達(dá)耐藥性基因盒的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究;同時(shí)建立一種適用于轉(zhuǎn)座子插入突變文庫篩選的、高通量的檢測整合酶介導(dǎo)的基因盒剪切頻率的方法,以便用于進(jìn)一步尋找宿主細(xì)菌中影響整合子捕獲耐藥性基因盒的因素。
　　1、臨床菌株整合子分子流行病學(xué)調(diào)查
　　為明確整合子在臨床菌株中的分布情況,同時(shí)為后續(xù)研究提供適當(dāng)?shù)恼献?、基?/p>

5、盒等材料,本研究首先對(duì)臨床菌株整合子進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查。運(yùn)用PCR篩查臨床菌株中的第1、2、3類整合子,第1類整合子陽性菌株對(duì)整合子可變區(qū)序列進(jìn)行分析。結(jié)果176株臨床菌株中第1、2、3類整合子陽性率分別為76％(134株)、1％(2株)、0％(0株),134株第1類整合子陽性菌株中有76株成功擴(kuò)增出可變區(qū),可變區(qū)中最常見的基因盒及排列為dfrA17-aadA5(34株)及dfrA12-orfF-aadA2(26株),同時(shí)在一株臨床菌

6、株中發(fā)現(xiàn)并命名了一種新的甲氧芐啶耐藥基因盒dfrA27。表明第1類整合子在臨床菌株中分布廣泛,其可變區(qū)中的基因盒均為賦予宿主菌對(duì)甲氧芐啶、氯霉素及早期使用的氨基糖苷類抗生素耐藥,提示整合子對(duì)耐藥性基因盒的捕獲與播散需一定的抗生素選擇壓力和時(shí)間。
　　2、第1類整合子快速基因定位方法的建立
　　整合子位于質(zhì)粒上,可隨質(zhì)粒的移動(dòng)而移動(dòng),從而加快了耐藥菌株的產(chǎn)生以及耐藥基因的播散,同時(shí)位于質(zhì)粒上的整合子中基因盒的表達(dá)還與質(zhì)粒的拷貝

7、數(shù)有關(guān),因此,確定整合子及耐藥基因是否位于質(zhì)粒上,對(duì)于耐藥基因播散機(jī)制的研究及感染控制均十分重要?，F(xiàn)有的基因定位方法均費(fèi)時(shí)且費(fèi)用高,本研究建立了一種基于實(shí)時(shí)定量PCR的方法,對(duì)臨床菌株中整合子基因定位進(jìn)行快速鑒定。對(duì)于同一細(xì)菌標(biāo)本,分別抽提質(zhì)粒、全基因組DNA或制備菌體煮沸裂解模板,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測第1類整合酶基因(inI1)與16SrDNA在上述3種模板中的拷貝數(shù),如果整合子位于染色體上,那么intI1拷貝數(shù)與16SrDNA拷貝

8、數(shù)的比值在不同模板中應(yīng)是相同的,相反,如果整合子位于質(zhì)粒上,質(zhì)粒模板中intI1拷貝數(shù)與16SrDNA拷貝數(shù)的比值(Rp)要高于全基因組。DNA或菌體煮沸裂解模板中intI1拷貝數(shù)與16SrDNA拷貝數(shù)的比值(Rg或Rb)。為提高檢測的特異性,將Rp/Rg或Rp/Rb大于4作為判斷整合子位于質(zhì)粒上的標(biāo)準(zhǔn)。運(yùn)用該方法對(duì)12株臨床菌株中的整合子進(jìn)行定位,結(jié)果該12株細(xì)菌中Rp/Rg或Rp/Rb均大于4(5.42-24.48),推測其均有整合

9、子位于質(zhì)粒上。用PFGE結(jié)合探針雜交對(duì)12株細(xì)菌中整合子基因定位進(jìn)行確認(rèn),結(jié)果該12株細(xì)菌中整合子均位于質(zhì)粒上,質(zhì)粒大小為48.5-240kbp不等。為進(jìn)一步確認(rèn)該方法可對(duì)位于染色體上的基因進(jìn)行定位,用該方法對(duì)10株lacZ基因(位于染色體上)陽性菌株中l(wèi)acZ基因進(jìn)行定位,結(jié)果該10株細(xì)菌中Rp/Rg或Rp/Rb均小于2(0.51-1.77)。與其它基因定位方法相比,該方法具有快速、簡便、費(fèi)用低、適用范圍廣、可計(jì)算整合子所在質(zhì)粒的拷貝

10、數(shù)等優(yōu)點(diǎn),可廣泛應(yīng)用于對(duì)其它基因或。DNA序列進(jìn)行快速定位。
　　3、第1類整合子中aadA2基因翻譯起始位點(diǎn)的確定
　　由于市場上缺乏相關(guān)的研究抗體,有關(guān)基因盒中基因在翻譯水平的研究的報(bào)導(dǎo)較少。aadA2基因是第1類整合子基因盒中最常見的基因之一,編碼產(chǎn)物為29kDa的氨基糖苷-3”-腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶[AAD(3”)],賦予細(xì)菌對(duì)鏈霉素和大觀霉素耐藥。aadA2基因讀碼框起始部位有兩個(gè)起始密碼子ATG和GTG,密碼子GTG上

11、游有核糖體結(jié)合位點(diǎn)被認(rèn)為是主要或唯一的起始密碼子,但從密碼子ATG起始也能合成一條完整的多肽鏈,但至今并沒有證據(jù)表明在細(xì)菌中aadA2基因可從ATG密碼子起始翻譯并合成有功能的蛋白。本研究通過制備抗AAD(3”)蛋白特異性多克隆抗體,對(duì)含有不同起始密碼子的aadA2基因翻譯產(chǎn)物進(jìn)行檢測,結(jié)果證實(shí)當(dāng)位于第1類整合子可變區(qū)第1位基因盒中,aadA2基因在細(xì)菌中可從上游不具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的ATG密碼子起始翻譯并合成有功能的AAD(3”)蛋白

12、,這一特性使得通過第1類整合酶介導(dǎo)整合入attI位點(diǎn)的基因盒,不需帶有核糖體結(jié)合位點(diǎn)即可起始基因盒中相應(yīng)讀碼框的翻譯,這更有利于第1類整合子表達(dá)從外界環(huán)境中捕獲的基因。
　　4、第1類整合子不同可變區(qū)啟動(dòng)子對(duì)基因盒表達(dá)水平的影響
　　第1類整合子中基因盒上游可變區(qū)啟動(dòng)子是影響基因盒轉(zhuǎn)錄水平的最主要因素之一。國內(nèi)外對(duì)于基因盒中基因在翻譯水平的研究大多用報(bào)告基因替代原有基因,研究結(jié)果并不能完全代表自然情況下整合子中基因盒在翻譯水

13、平的表達(dá)情況。本研究通過構(gòu)建8種含有不同可變區(qū)啟動(dòng)子的整合子,運(yùn)用第三部分制備的抗AAD(3”)多克隆抗體,觀察其對(duì)下游aadA2基因盒中aadA2基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的影響。結(jié)果強(qiáng)Pant啟動(dòng)子聯(lián)合有活性的P2啟動(dòng)子下游aadA2基因的表達(dá)水平最高,比表達(dá)水平最低的弱Pant啟動(dòng)子下游aadA2基因在轉(zhuǎn)錄水平要高出約200倍,在翻譯水平要高出約15倍,并首次檢測了雜合2型Pant啟動(dòng)子聯(lián)合有活性的P2啟動(dòng)子下游基因盒中aadA2基因的

14、表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)其僅次于強(qiáng)Pant啟動(dòng)子聯(lián)合有活性的P2啟動(dòng)子及強(qiáng)Pant啟動(dòng)子聯(lián)合無活性的P2啟動(dòng)子。
　　5、第1類整合子不同可變區(qū)啟動(dòng)子對(duì)基因盒整合頻率的影響
　　第1類整合子可變區(qū)啟動(dòng)子位于基因盒重組位點(diǎn)attI上游,可變區(qū)基因盒在可變區(qū)啟動(dòng)子的作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)需經(jīng)過attI位點(diǎn),并使attI位點(diǎn)雙鏈解開,可能影響整合酶蛋白與雙鏈attI位點(diǎn)結(jié)合,從而對(duì)整合酶介導(dǎo)的基因盒位點(diǎn)特異性重組產(chǎn)生影響。因此本研究對(duì)第1類整合子

15、中不同可變區(qū)啟動(dòng)子對(duì)基因盒整合頻率的影響進(jìn)行研究。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測高表達(dá)整合酶的條件下,基因盒插入不同可變區(qū)啟動(dòng)子下游attI位點(diǎn)的整合頻率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)含弱。Pant啟動(dòng)子的整合子中基因盒的整合頻率最高,是整合頻率最低的強(qiáng)Pant啟動(dòng)子聯(lián)合有活性P2啟動(dòng)子的整合子中基因盒整合頻率的74倍,同時(shí)發(fā)現(xiàn)整合子中基因盒的整合頻率與P2啟動(dòng)子種類密切相關(guān),在含有無活性P2啟動(dòng)子的整合子中基因盒的整合頻率明顯高于含有有活性P2啟動(dòng)子的整合子,在

16、含有相同P2啟動(dòng)子的整合子中基因盒的整合頻率與整合子可變區(qū)基因盒的表達(dá)水平成負(fù)相關(guān)。提示整合子需要基因盒高表達(dá)以適應(yīng)外界環(huán)境時(shí),可通過降低整合頻率以維持整合子結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定。
　　6、利用“乳頭狀試驗(yàn)”檢測基因盒剪切頻率的方法的建立
　　研究表明細(xì)菌處于應(yīng)激狀態(tài)下,整合頻率會(huì)大大提高,表明不同的外界環(huán)境可影響整合子捕獲基因盒的效率,而外界環(huán)境的變化是通過細(xì)菌體內(nèi)不同基因表達(dá)水平的變化而影響整合子捕獲基因盒的效率的,因此,宿主

17、菌中可能存在著影響整合子捕獲基因盒效率的因素。轉(zhuǎn)座子插入突變文庫是比較成熟的篩選細(xì)菌中影響某一表型或生物學(xué)性狀的基因的方法,但現(xiàn)有的檢測整合子中基因盒剪切與整合頻率的方法都不適用于對(duì)大規(guī)模轉(zhuǎn)座子插入突變文庫進(jìn)行高通量篩選。本研究建立一種利用“乳頭狀試驗(yàn)”檢測整合子中基因盒剪切頻率的方法。Laca基因的讀碼框由于基因盒aadA5的插入而不能翻譯成有功能的β-半乳糖苷酶的α片段,當(dāng)laca基因讀碼框內(nèi)插入的基因盒aadA5在整合酶蛋白的作用

18、下被剪切下來,laca基因讀碼框能翻譯成有功能的β-半乳糖苷酶的α片段,在大腸桿菌JM109中能發(fā)生α互補(bǔ)現(xiàn)象,由于基因盒aadA5的剪切是在細(xì)菌生長過程中發(fā)生的,因此在含X-gal與IPTG的平板上,在長出的白色菌落中會(huì)出現(xiàn)基因盒aadA5發(fā)生剪切的細(xì)菌生長所形成的藍(lán)色斑點(diǎn),而藍(lán)色斑點(diǎn)出現(xiàn)的早晚、數(shù)量的多少與剪切頻率有關(guān),可通過觀察藍(lán)色斑點(diǎn)出現(xiàn)的早晚以及計(jì)數(shù)白色菌落中藍(lán)色斑點(diǎn)的數(shù)量來評(píng)價(jià)剪切頻率。該方法具有簡便、高通量、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn),