山東省濟(jì)南市區(qū)廢水環(huán)境中整合子細(xì)菌篩選及耐藥性機(jī)制研究.pdf

1、近年來由于抗生素的廣泛應(yīng)用治療各類感染，使細(xì)菌耐藥問題越來越嚴(yán)重，從而導(dǎo)致了細(xì)菌多重耐藥性(Multidrug resistance，MDR)的現(xiàn)象。不斷的濫用抗生素使得人體乃至自然環(huán)境為細(xì)菌進(jìn)化為多重耐藥性細(xì)菌提供了選擇壓力并使細(xì)菌耐藥性得以廣泛的傳播。整合子是一種可移動(dòng)元件，在整合酶作用下，識(shí)別重組位點(diǎn)，通過位點(diǎn)特異性重組剪切、捕獲并整合細(xì)胞外游離的基因盒，并借助整合子的強(qiáng)啟動(dòng)子使功能性基因得以表達(dá)的遺傳系統(tǒng)；整合子的基因盒大部分是

2、具編碼多種水解酶或修飾酶、外排泵等與細(xì)菌耐藥性相關(guān)基因。
　　 臨床上具有不同耐藥基因的致病菌會(huì)以各種方式流入環(huán)境中，環(huán)境細(xì)菌通過基因的水平轉(zhuǎn)移，可以從流入環(huán)境中的臨床致病菌中獲得耐藥性基因。在耐藥基因轉(zhuǎn)移過程中，往往會(huì)發(fā)生突變或重組，進(jìn)而產(chǎn)生新的耐藥基因或新的多重耐藥性基因的組合。反過來，這些新的耐藥因子有可能再從環(huán)境細(xì)菌轉(zhuǎn)入臨床致病菌，經(jīng)過空氣、食物或水來感染人體，在臨床上產(chǎn)生耐藥性，對人類健康具有極大的危害。在抗菌藥物選擇

3、壓力環(huán)境下，整合子隨轉(zhuǎn)座子、接合性質(zhì)粒一同發(fā)生水平轉(zhuǎn)移具有使耐藥性在細(xì)菌之間傳播的功能，是細(xì)菌競爭生存、適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制之一，也是耐藥性傳播的重要途徑。
　　 我們這項(xiàng)研究是通過調(diào)查濟(jì)南地區(qū)醫(yī)院周邊生活廢水中整合子細(xì)菌的發(fā)生率以及其含有的耐藥基因盒結(jié)構(gòu)，目的是發(fā)掘、鑒定一些新型的整合子結(jié)構(gòu)。從基因水平上分析細(xì)菌的耐藥及其轉(zhuǎn)移的機(jī)制，說明抗菌藥物濫用的危害性從而指導(dǎo)抗菌藥物的正確使用，防止抗菌藥物的濫用；根據(jù)細(xì)菌耐藥的機(jī)制，有目的的

4、開發(fā)一些新型抗菌藥物。
　　 本文主要的工作內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.通過膜過濾法從濟(jì)南市區(qū)廢水環(huán)境中篩選耐藥性細(xì)菌，對所有耐藥性菌株的1型、2型、3型整合酶通過PCR分別進(jìn)行檢測
　　 從2008年至2009年各大醫(yī)院廢水處理廠周邊的廢水樣品；濟(jì)南齊魯制藥廠下游小清河地下水、工程改造地下抽去的排水及藥廠豬圈廢水；廢水處理廠處理前廢水及部分天然少污染的濟(jì)南周邊泉水共15個(gè)不同時(shí)間的樣品進(jìn)行分析。篩選出391株不

5、同耐藥性腸桿菌菌株，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，通過抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)分析菌株對常用抗菌藥物耐藥性，發(fā)現(xiàn)菌株對氨芐西林、甲氧芐啶、硫代異唑的耐藥性大于85％。通過1、2、3型整合酶引物intI1F/R，intI2F/R和intI3F/R進(jìn)行PCR檢測，其中1型整合子比率為59.3％，2型整合子的比率為9.2％，未篩選到3型整合酶陽性的菌株。391株菌株藥物敏感性結(jié)果與整合子篩選結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，含有整合子的耐藥細(xì)菌對氨芐西林、甲氧芐啶和硫代異唑三種抗

6、菌藥物的耐藥率高達(dá)90％以上，非整合子細(xì)菌氨芐西林的耐藥性也高達(dá)87.2％，除了磷霉素外，耐藥性含整合子細(xì)菌比不具有該結(jié)構(gòu)的菌株耐藥性的比率高10％～20％。
　　 2.對1型整合子可變區(qū)采用PCR擴(kuò)增，通過PCR產(chǎn)物大小、PCR產(chǎn)物RFLP圖譜分析及測序結(jié)果機(jī)型分析
　　 根據(jù)1型整合子可變區(qū)根據(jù)其保守的5'CS和3'CS設(shè)計(jì)引物hep58，hep59進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)PCR產(chǎn)物大小從0.2kb至6.3kb，PCR產(chǎn)物Ec

7、oRⅡ酶切圖譜分析，發(fā)現(xiàn)34種不同酶切圖譜，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)35種不同的基因盒陣列，具有42種不同的基因盒。35種基因盒陣列中九種基因盒陣列屬于新的排列組合，16SrRNA分析，九株菌包含6個(gè)屬：氣單胞菌屬、克雷伯菌屬、大腸桿菌屬、從毛假單胞菌屬、普羅維登斯菌屬和奇異變形桿菌屬。9種新型基因盒陣列如下所示：orfⅠ；arr3-dfrA27；aadA△16-acc(6′)-Ⅱ；aac(6′)-Ⅰb-blaOXA-1-catB3；aacA4-o

8、rfun-aacA4-catB3；dhfrⅤ-aac(6′)-Ⅱ-nit1-nit2-catB3-blaOXA-1；aac(6′)-Ⅰb-cr-arr3-dfrA27-aadA16-ⅠS26aadB-cat-blaOXA-10-aadA1-dfrA1-aacA4aadB-cat-blaOXA-10-aadA1-orfⅡ。232株具有1型整合子的基因盒陣列中，dfrA17-aadA5排列方式是最多的一種，占43.5％，其次是dfrA12-

9、orfF-aadA2陣列，占19.3％。
　　 3.對共篩選出36株2型整合子進(jìn)行分析，其中含有5種不同的基因盒排列組合，接合轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)化方法分析2型整合子的水平轉(zhuǎn)移性
　　 用于擴(kuò)增2型整合子可變區(qū)hep74和hep51引物成功擴(kuò)增到5種不同的PCR產(chǎn)物4.3kb，3.0kb，2.Skb和2.2kb及時(shí)隱時(shí)現(xiàn)的2.5kb片段大小。PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T測序結(jié)果顯示分別為linF-dfrA1-aadA1-orf44

10、1；dfrA1-catB2-sat2-aadA1；estⅩvr-sat-aadA1，dfrA1-sat2-aadA1及雜合型的dfrA1-sat2-aadA1-qacH基因盒陣列。36株2型整合子細(xì)菌根據(jù)PEP圖譜進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)其可以分為15類，16S rRNA測序結(jié)果顯示19株屬于奇異變形桿菌屬，大腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬各7株，費(fèi)氏檸檬酸桿菌、志賀氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬各1株。接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及脈沖場電泳及Southern雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

11、表明除E.coli C4雜合型2型整合子外，其余新型2型基因盒陣列均位于染色體上。采用Tn7類轉(zhuǎn)座子特有序列tnsD，tnsE進(jìn)行檢測，除2株雜合型2型整合子不具有此類保守序列外，其余34株2型整合子均屬于Tn7轉(zhuǎn)座子家族。在雜合型2型整合子下游鑒定存在IS26，tnp440和sul3基因。
　　 4.Aeromonas puctata中新型喹諾酮耐藥性基因qnrVC4的克隆及活性分析
　　 從Aeromonas puc

12、tata基因盒3.3kb aacA4-orfun-aacA4-catB3比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)中間1kb序列功能未知，具有218氨基酸的開放閱讀框，GenBank比對結(jié)果顯示其與QnrB6，QmrA1，QnrS1，QnrC，QnrVC1和QnrVC3具有45％-81％的相似性。根據(jù)核苷酸、氨基酸序列相似性及其attC重組位點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)的分析，根據(jù)qnr基因命名的法則，將此基因命名為qnrVC4。接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)均未獲得該菌株相應(yīng)的轉(zhuǎn)移子。采用堿

13、裂解法提取質(zhì)粒，脈沖場電泳，23S rRNA探針雜交對染色體定位，然后用qnrVC4探針進(jìn)行雜交分析，結(jié)果表明該基因位于一大質(zhì)粒上，并且該質(zhì)粒不可以發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。利用pBC KS(+)的Lac啟動(dòng)子及整合子本身的啟動(dòng)子PcWTGN-10進(jìn)行表達(dá)。將657bp的qnrVC4及含有啟動(dòng)子、aacA4、qnrVC4基因的1.8kb的PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pBC KS(+)中，在E.coliTop10中成功構(gòu)建重組子pBCKS-qnrVC4和pB

14、CKS-Pt-qnrVC4。重組子pBCKS-qnrVC4對環(huán)丙沙星、加替沙星、萘啶酮酸最小抑菌濃度(MICs)結(jié)果分別為0.032，0.047和4μg/mL；重組子pBCKS-Pt-qnrVC4結(jié)果分別為0.008，0.006和2μg/mL。分析此菌株染色體上GyrA，GyrB和ParC的喹諾酮耐藥性決定區(qū)域(QRDR)發(fā)現(xiàn)GyrA Ser-83-Ile突變是該菌株喹諾酮耐藥性的主要原因。
　　 5.分析391株耐藥細(xì)菌中質(zhì)粒

15、介導(dǎo)的喹諾酮耐藥性基因qnrA，qnrB，qnrS的分布
　　 雖然QnrA，QnrB和QnrS蛋白在喹諾酮耐藥性的貢獻(xiàn)非常小，但是qnrA，qnrB和qnrS通常位于質(zhì)粒上并成為喹諾酮耐藥性水平轉(zhuǎn)移的主要方式，并且此類基因的水平轉(zhuǎn)移為獲得高喹諾酮耐藥性提供可能。從391株篩選的不同耐藥菌株中31株具有qnr類基因，其中2株具有qnrA基因；9株具有qnrS基因陽性菌株；17株qnrB基因陽性菌株，3株同時(shí)含有qnrB，qnrS

16、基因。通過兩對引物進(jìn)行PCR，并且通過PCR-RFLP的方法對qnrB基因變體進(jìn)行了詳細(xì)的分析，此分析法的結(jié)果與測序結(jié)果相一致，可以用來大量快速鑒定qnrB基因變體并發(fā)現(xiàn)新型qnrB變體。與喹諾酮耐藥性相關(guān)的aac(6')-Ⅰb-cr基因與qnr基因同時(shí)存在可以提高喹諾酮耐藥性，在31株菌中檢測到12株菌具有該基因。與喹諾酮相關(guān)的外排泵基因qepA僅在1株qnrB菌株中和4株qnrS菌株中檢測到。接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)18株菌株的q

17、nr基因可以發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。
　　 6.調(diào)查391株耐藥性菌株中ISCR1介導(dǎo)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)的1型整合子及具有該元件菌株的耐藥性機(jī)制分析
　　 本實(shí)驗(yàn)調(diào)查了391株菌株含有ISCR1元件的概率，發(fā)現(xiàn)其中有41株具有ISCR1元件，包括所有含有qnrA，qnrB的菌株。采用ISCR1元件的保守序列設(shè)計(jì)引物513BF和3'CS的qac△EB引物及SEFA-PCR分析ISCR1元件下游所攜帶的耐藥性基因，從中發(fā)現(xiàn)了11種不同的結(jié)構(gòu)，

18、包括ISCR1-qnrA-ampR-qac△E-sull，SCR1-qnrB2-qac△E-sull，ISCR1-qnrB6-qac△E-sull，ISCR1-dfrA10-qac△E-sull，ISCR1-tnpU-armA，ISCR1-dfrL-qac△E-Sull，ISCR1-dfrM-qac△E-sull，ISCR1-dfrN-qac△E-sull，ISCR1-dfrA19-intⅠ1-catB3-aadB-qac△E-sull