線粒體端粒酶過表達(dá)對人肝癌細(xì)胞耐藥性的影響.pdf

1、背景:肝細(xì)胞癌是世界上第五大常見癌癥,且80％的原發(fā)性肝癌為肝細(xì)胞癌。肝細(xì)胞癌患者5年生存率低至7%,每年全世界大約超過60萬人死于肝癌。肝細(xì)胞癌對于現(xiàn)存的化療藥物以及化療方案極度不敏感,往往缺乏有效的治療手段。
　　多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是制約化療藥物在肝癌患者臨床應(yīng)用的主要障礙。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制復(fù)雜,已知一些遺傳學(xué)和/或表觀遺傳學(xué)的改變能增加化療藥物從細(xì)胞中排出、減少細(xì)胞對化療藥物的

2、攝入;激活DNA修復(fù)和藥物的代謝;細(xì)胞信號(hào)通路的激活/失活;阻斷凋亡通路等。
　　大多數(shù)化療藥物,包括順鉑、5-氟尿嘧啶、阿霉素等常用化療藥物都通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其抗腫瘤作用。在大多數(shù)細(xì)胞包括肝細(xì)胞,這種凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要線粒體的參與。
　　大多數(shù)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)hTERT,故hTERT可作為臨床抗腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。研究證實(shí),hTERT表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的耐藥性相關(guān)。端粒酶作為一種反轉(zhuǎn)錄酶,主要在胚胎干細(xì)胞、生殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞

3、核內(nèi)高表達(dá),依賴自身模板(TERC)和催化蛋白(TERT)維持端粒的長度。研究發(fā)現(xiàn),端粒酶還具有非端粒依賴的功能,如促進(jìn)參與細(xì)胞生長和增殖的基因的表達(dá)、DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡途徑的調(diào)控等等。
　　細(xì)胞中端粒酶具有多種調(diào)控方式,其中,端粒酶在亞細(xì)胞的定位是其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式之一。線粒體端粒酶有其特殊的作用方式。研究表明,線粒體 hTERT能以線粒體RNA為模板發(fā)揮逆轉(zhuǎn)錄酶作用(RdDP);線粒體hTERT可以與線粒體RNA核

4、糖核酸酶的RNA部分(RMRP)結(jié)合發(fā)揮基因沉默作用;此外,線粒體hTERT可以保護(hù)線粒體功能和阻止細(xì)胞凋亡。因此,推測線粒體端粒酶有可能通過增強(qiáng)線粒體功能,阻斷細(xì)胞凋亡通路參與腫瘤細(xì)胞MDR的發(fā)生。
　　目的:
　　本研究通過觀察線粒體端粒酶表達(dá)與肝癌細(xì)胞化療耐藥的關(guān)系,探討肝癌細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)生的機(jī)制。
　　方法:
　　采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建靶向線粒體表達(dá)hTERT的慢病毒載體PLE-mito–hTERT,采用D

5、NA測序、激光共聚焦顯微鏡和Western bot檢測線粒體hTERT表達(dá),以驗(yàn)證載體構(gòu)建的正確性;采用CCK-8試劑盒檢測肝癌細(xì)胞耐藥狀態(tài);免疫熒光測定caspase-3的活化狀態(tài);TMRE探針檢測線粒體膜電位水平;流式檢測凋亡水平;Q-PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)目變化;
　　結(jié)果:
　　1、DNA測序表明靶向線粒體表達(dá)hTERT慢病毒載體PLE-mito–hTERT構(gòu)建序列正確;與HepG2(1.727±0.534)和

6、HepG2-PLE細(xì)胞(2.687±1.280)相比,HepG2-mito-hTERT細(xì)胞(14.880±6.644)線粒體熒光共定位信號(hào)增強(qiáng)(P<0.01);同樣地,與SK-Hep1(0.706±0.299)和SK-Hep1-PLE細(xì)胞(0.873±0.366)相比,SK-Hep1-mito-hTERT細(xì)胞(22.24±0.558)線粒體熒光共定位信號(hào)亦增強(qiáng)(P<0.01);與親本細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞相比, SK-Hep1-mito-h

7、TERT和 HepG2-mito-hTERT細(xì)胞核內(nèi) hTERT表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05),而線粒體 hTERT表達(dá)明顯升高(P<0.05)。證明靶向線粒體表達(dá)hTERT慢病毒載體PLE-mito–hTERT構(gòu)建成功。
　　2、 SK-Hep1-mito-hTERT和 HepG2-mito-hTERT細(xì)胞對化療藥物 CDDP、5-FU和DOX的耐受性增加。
　　(1)1-16μg/mL CDDP組,與HepG2和He

8、pG2-PLE細(xì)胞相比, HepG2-mito-hTERT細(xì)胞(0.120±0.018、0.320±0.006、0.499±0.018、0.555±0.019、0.623±0.006)相對抑制率顯著降低(P<0.05);
　　(2)4-32μg/mL5-FU組,與 HepG2和HepG2-PLE相比較, HepG2-mito-hTERT(0.207±0.016、0.320±0.006、0.499±0.018、0.555±0.019

9、)耐藥性顯著增加(P<0.05);
　　(3)0.15-2.5μg/mL DOX組,與 HepG2和HepG2-PLE細(xì)胞相比較, HepG2-mito-hTERT細(xì)胞(0.165±0.023、0.229±0.007、0.410±0.011、0.509±0.066、0.562±0.009)耐受性均顯著性增強(qiáng)(P<0.05);
　　(4)同樣地,1-16μg/mL CDDP組,與相同濃度組 SK-Hep1、SK-Hep1-PL

10、E細(xì)胞相比較, SK-Hep1-mito-hTERT細(xì)胞相對抑制率(0.083±0.017、0.151±0.063、0.234±0.021、0.387±0.022、0.624±0.013)均有顯著性差異(P<0.05)。
　　(5)2-8μg/mL5-FU組,與相同濃度組 SK-Hep1、SK-Hep1-PLE細(xì)胞相比較, SK-Hep1-mito-hTERT細(xì)胞(0.275±0.058、0.458±0.042、0.670±0.0

11、64)相對抑制率均有顯著性差異(P<0.05)。
　　(6)0.15-1.25μg/mL DOX組,與相同濃度組 SK-Hep1、SK-Hep1-PLE細(xì)胞相比較,SK-Hep1-mito-hTERT細(xì)胞(0.112±0.008、0.294±0.007、0.740±0.018)相對抑制率均有顯著性差異(P<0.05)。
　　3、與陰性對照細(xì)胞相比,HepG2-mito-hTERT和SK-Hep1-mito–hTERT細(xì)胞均能

12、減少藥物應(yīng)激導(dǎo)致的caspase-3激活(P<0.05);此外,與母本細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞相比, HepG2-mito-hTERT細(xì)胞能夠減少多種藥物誘導(dǎo)的凋亡(P<0.05);
　　4、與母本細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞相比,HepG2-mito-hTERT細(xì)胞能減少藥物應(yīng)激導(dǎo)致的MMP降低(P<0.05)。
　　5、與母本細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞相比,HepG2-mito-hTERT在藥物刺激前后線粒體DNA拷貝數(shù)均增加(P<0.05);