三氧化二砷對人胃癌細胞端粒酶活性的影響及端粒酶在人胃癌基因治療中的應用.pdf

1、胃癌在中國各種惡性腫瘤中占首位,每年死于胃癌的患者約16萬.因此,針對胃癌治療的研究成為臨床和基礎(chǔ)研究工作的重點,特別是隨著人類基因組計劃的完成,基因治療將成為二十一世紀腫瘤治療的重點策略.端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白聚合酶,它能以自身的RNA作為模板合成端粒,彌補端粒丟失,對維持端粒長度,使細胞獲得永生化起重要作用.端粒酶是迄今發(fā)現(xiàn)的一個最為廣譜和特異的腫瘤標志物,與細胞衰老、永生化和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系.端粒酶之所以能成為腫瘤

2、治療的新靶點,在于大多數(shù)正常組織中沒有活性或活性極低,而85﹪以上的惡性腫瘤具有很高的端粒酶活性.人的端粒酶復合物由多種成份組成,但是端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)卻是控制端粒酶活性的關(guān)鍵組分.在細胞永生和腫瘤進展過程中端粒酶的激活需要誘導hTERT的表達.最近的研究報道,hTERT基因與端粒酶活性具有密切的相關(guān)性.因此,利用hTERT基因作為腫瘤治療的靶點,將

3、使基因治療更具有明確的靶向性.基于此思路,我們首先研究了三氧化二砷對人胃癌細胞端粒酶活性的影響及可能的作用機制,為三氧化二砷作為端粒酶抑制劑用于胃癌的治療提供新的理論依據(jù).其次,我們探討了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因在人胃癌細胞基因治療中的作用.論文一 三氧化二砷對人胃癌BGC-823細胞端粒酶的影響;目的:研究三氧化二砷對人胃癌BGC-823細胞端粒酶的影響及可能的作用機制.方法:以不同濃度的三氧化二砷作用于人胃癌BGC-823細胞,通過MTT

4、法測定細胞活力;流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化及凋亡;TRAP PCR ELISA方法檢測細胞端粒酶活性的變化;RT-PCR半定量方法檢測細胞端粒酶hTERT基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平.三氧化二砷對人胃癌BGC-823細胞的抑制作用可能是通過二條途徑實現(xiàn)：一是誘導細胞凋亡，另一個是通過下調(diào)hTERT基因mRNA的轉(zhuǎn)錄來下調(diào)細胞的端粒酶活性.論文二 端粒酶反義hTERT基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建;目的：構(gòu)建反義人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT)基因真核

5、表達載體.方法：一步法從人慢性髓原白血病細胞株K562細胞中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應（RT-PCR）擴增出人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因起始密碼子至下游長156個堿基的DNA片斷，反向連入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX的限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和Cla Ⅰ酶切位點上，即構(gòu)建成hTERT的反義表達載體，并經(jīng)酶切鑒定和測序確認.結(jié)論：成功構(gòu)建了人端粒酶hTERT基因反義表達載體，為進一步研究反義hTERT基因轉(zhuǎn)染對胃癌細胞端粒酶及生物學行為的

6、影響奠定了基礎(chǔ).論文三 端粒酶反義hTERT基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細胞系的影響;目的：將構(gòu)建成功的人端粒酶反義hTERT基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染人未分化胃癌細胞系HGC-27，并觀察其對人胃癌細胞生物學特性的影響，探討反義hTERT基因治療的可行性.結(jié)論：外源端粒酶反義hTERT基因通過封閉hTERT基因的mRNA，抑制其表達，從而抑制胃癌細胞端粒酶活性，進一步顯著抑制HGC-27細胞的生長并促進其凋亡.端粒酶反義hTERT基因，可能應用于胃癌