穩(wěn)定干擾端粒酶催化亞基及轉(zhuǎn)錄因子對SGC-7901細(xì)胞增殖和端粒酶活性的影響.pdf

1、利用RNAi技術(shù)高效、特異地阻斷癌基因表達(dá)是治愈腫瘤的希望。研究表明，85％以上的惡性腫瘤組織表達(dá)端粒酶活性，而正常組織細(xì)胞缺乏端粒酶活性。端粒酶催化亞基hTERT是端粒酶的核心組分，也是端粒酶活性的限速因子，在80％-90％的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，在細(xì)胞永生化和腫瘤形成中起主要作用，因此成為理想的抑瘤靶點。hTERT基因表達(dá)調(diào)控主要分為兩個關(guān)鍵階段：轉(zhuǎn)錄激活因子對hTERT啟動子的激活--啟動轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。由于端粒酶活性抑制與細(xì)胞

2、增殖抑制之間存在“滯后現(xiàn)象”，長效的端粒酶活性抑制是獲得較好的抗癌效果的保證。本研究利用載體表達(dá)的shRNA可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，具有長效干擾作用的特性，擬在hTERT基因表達(dá)調(diào)控的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)對hTERT基因表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，探討其抗腫瘤效應(yīng)。 1、構(gòu)建靶向hTERT、TRAP基因的shRNA表達(dá)載體psi-hTERT、psl-TRAP 化學(xué)合成編碼靶向端粒酶hTERT及其轉(zhuǎn)錄激活因子基因TRAPmRNA序列的短發(fā)夾寡核苷

3、酸序列(各63個堿基)，經(jīng)退火后克隆到線性化的psilencer<'TM>2.1-U6 neo表達(dá)載體。重組構(gòu)建的psi-hTERT、psi-TRAP載體經(jīng)雙酶切電泳分析及插入基因片段序列分析，結(jié)果表明63個堿基對成功插入到預(yù)計位點，并且序列完全一致。說明成功構(gòu)建了psi-hTERT、psi-TRAP shRNA表達(dá)質(zhì)粒。 2、psi-hTERT對SGC-7901細(xì)胞端粒酶活性和細(xì)胞增殖的長效影響 將構(gòu)建的psi-hTE

4、RTl和psi-hTERT2用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，然后用G418篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)克隆后，半量G418N力培養(yǎng)3個月，real-time PCR檢測hTERT基因mRNA表達(dá)，western blot檢測hTERT蛋白水平、TRAP-ELISA方法檢測細(xì)胞端粒酶活性，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。實驗結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染psi-hTERT的實驗組與對照組比較，hTERT mRNA表達(dá)水平psi-hTERTl組下降75.1％，psi

5、-hTERT2組下降85.9％，hTERT蛋白psi-hTERTl組下降68.6％，psi-hTERT2組下降80.4％，端粒酶活性水平psi-hTERTl組下降36.36％，psi-hTERT2組下降51.19％，均具有顯著性差異。與對照組比較，兩實驗組細(xì)胞增殖明顯減慢，細(xì)胞凋亡率增加。結(jié)果提示，設(shè)計的針對hTERT基因的兩對靶序列是有效的，載體表達(dá)的shRNA 在SGC-7901細(xì)胞內(nèi)具有長效的端粒酶活性抑制作用和抗腫瘤效應(yīng)，hTE

6、RT是腫瘤基因治療的有效靶點。 3、psi-TRAP對SGC-7901細(xì)胞端粒酶活性和細(xì)胞增殖的影響 將構(gòu)建的psi-TRAPl和用psi-TRAP2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，然后用G418篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)克隆后，半量G418N力培養(yǎng)3個月，real-time PCR方法檢TRRAP基因、hTERT基因的mRNA水平實驗結(jié)果顯示，psi-TRAPl組抑制效率達(dá)85.0％；psi-TRAP2組抑制效率為54.6％

7、。hTERT基因的mRNA水平也降，psi-TRAP1組為0.136± 0.02、psi-TRAP2組為0.315±0.03，明顯低于psi-control組0.382±0.03。 Western blot檢測hTERT蛋白水平，psi-TRAPl組0.463±0.01， psi-TRAP2組1.35±0.04，psi-control組為1.980±0.01。TRAP-ELISA檢測細(xì)胞端粒酶活性，psi-TRAPl組抑制率達(dá)36.3％

8、，psi-TRAP2組抑制率為7.1％。實驗組與對照組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。與對照組比較，實驗組細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞凋亡率增加。結(jié)果提示：設(shè)計針對TRAP基因的兩對靶序列也是有效的，可以顯著性降低TRAP基因的表達(dá)，從而下調(diào)hTERT基因啟動子活性，降低hTERT基因的轉(zhuǎn)錄水平，使hTERT mRNA和蛋白水平降低，細(xì)胞端粒酶的活性下降，具有抗腫瘤效應(yīng)，是腫瘤基因治療的又一途徑。 4、聯(lián)合干擾hTERT不同靶序列及其

9、轉(zhuǎn)錄激活因子基因TRAP對SGC-7901細(xì)胞的影響 為了尋找更為有效的端粒酶抑制途徑，探討同時干擾hTERT基因及其轉(zhuǎn)錄激活因子基因TRAP是否具有協(xié)同下調(diào)端粒酶活性的作用，我們將psi-hTERTl分別與psi-hTERT2和psi-TRAPl聯(lián)合共轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，檢測其對hTERT基因表達(dá)、端粒酶活性、SGC-7901細(xì)胞增殖的影響。實驗結(jié)果表明，兩聯(lián)合干擾組與對照組比較，hTERT基因的表達(dá)在mRNA、蛋白水平

10、明顯下調(diào)，細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞凋亡率增加。但psi-hTERTl聯(lián)合psi-TRAPl組與對照組比較無顯著性差別。 5、穩(wěn)定干擾hTERT聯(lián)合化療藥物對SGC-7901細(xì)胞增殖活性的影響 選擇兩種常用的化療藥物DDP、5-FU分別聯(lián)合psi-hTERT1和 psi-hTERT2，探討psi-hTERT表達(dá)載體對化療藥物的增敏作用，MTT檢測結(jié)果表明psi-hTERT可以提高SGC-7901細(xì)胞對化療藥物的敏感性。