再生障礙性貧血患者端粒和端粒酶活性的變化.pdf

1、研究背景:端粒是近年來生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，隨著相關(guān)研究的不斷深入，已逐漸引起國內(nèi)外血液病工作者的關(guān)注。端粒長度縮短和端粒酶相關(guān)基因突變可以導(dǎo)致造血干細(xì)胞衰老，嚴(yán)重影響造血干細(xì)胞的植入效率，是骨髓衰竭性疾病的發(fā)病原因之一。再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是最常見的骨髓衰竭性疾病，主要表現(xiàn)為骨髓造血功能低下，造血干祖細(xì)胞數(shù)量減少伴功能異常，導(dǎo)致全血細(xì)胞減少。AA病因及發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，呈現(xiàn)高度異質(zhì)性，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其

2、機(jī)制可以歸納為“種子、土壤、蟲子”學(xué)說，即“造血干細(xì)胞的損傷、造血微環(huán)境的異常以及免疫功能紊亂”。近年來普遍認(rèn)為AA是一種以造血干祖細(xì)胞為靶向的自身免疫性疾病，約70％的患者經(jīng)免疫抑制治療(immunosuppressive therapy，IST)獲得改善，而仍有約30％的AA患者應(yīng)用IST無效，這部分患者發(fā)病機(jī)制可能另有原因。近年研究發(fā)現(xiàn)AA的發(fā)病表現(xiàn)出一定的宿主遺傳易感性，特別是一些關(guān)于端粒長度、端粒酶相關(guān)基因突變等研究發(fā)現(xiàn)，端粒

3、酶基因突變可導(dǎo)致酶活性的減低，加速端?？s短，使造血前祖細(xì)胞增殖能力下降。端粒是真核細(xì)胞線性染色體的末端，由DNA3'端的6個核苷酸短串聯(lián)重復(fù)序列(5'TTAGGG3')及其互補(bǔ)序列構(gòu)成的雙鏈結(jié)構(gòu)，其富含T、G堿基，由DNA及其相關(guān)蛋白組成。端粒為非結(jié)構(gòu)基因，不編碼蛋白質(zhì)，是細(xì)胞進(jìn)化過程中一段高度保守的序列，端?？杀Ｗo(hù)染色體不被核酸酶降解、防止染色體末端相互融合，在維持染色體完整方面發(fā)揮了重要的作用。目前發(fā)現(xiàn)有兩種端粒長度調(diào)控機(jī)制，主要為

4、端粒酶途徑以及端粒延長替代機(jī)制(Alternative lengthing oftelomere，ALT)。端粒酶是一種自身攜帶模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，為RNA模板及具有催化調(diào)控功能的各種蛋白亞基構(gòu)成的核糖核蛋白復(fù)合體，端粒酶能以自身RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄機(jī)制合成(TTAGGG)n序列，即于端粒末端添加DNA重復(fù)序列，以抵消或延緩細(xì)胞分裂活動引起的末端縮短問題。既往研究發(fā)現(xiàn)，部分AA患者存在端?？s短情況，且這部分端粒縮短的AA患者疾病持續(xù)時間

5、更長，治療后更易復(fù)發(fā)，進(jìn)展為晚期惡性克隆性疾病的可能性更大，如轉(zhuǎn)化MDS、PNH和AML等。也有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)存在端粒酶突變的AA患者，臨床上對IST治療多不敏感，但沒有同時檢查端粒酶活性，并按照療效分組比較及統(tǒng)計(jì)，且端粒酶突變檢測陽性率較低，費(fèi)用高，臨床應(yīng)用受到局限?；诙肆ＥcAA的相關(guān)性，以往研究檢測標(biāo)本多為外周血白細(xì)胞或粒細(xì)胞，外周血白細(xì)胞主要由單個核細(xì)胞及粒細(xì)胞組成，AA患者粒細(xì)胞缺乏，標(biāo)本不易獲得，然而AA患者多伴有淋巴細(xì)胞

6、比例增加，因而本研究取外周血單個核細(xì)胞作為標(biāo)本來源。選取近年來發(fā)展的流式-熒光原位雜交法(Flow-FISH)，利用端粒特異性探針(PNA)檢測端粒長度的新方法，其與既往Southern blot、Q-PCR等方法有很好的相關(guān)性，且所需樣品量少（細(xì)胞數(shù)少于105個），靈敏度高，可以檢測出小于3kb的端粒長度，操作快捷，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，并同時采用TRAP-PCR-ELISA方法檢測標(biāo)本細(xì)胞端粒酶活性。
　　 目的:觀察再生障礙

7、性貧血患者外周血單個核細(xì)胞的端粒長度、端粒酶活性的變化，探討端粒長度及端粒酶活性變化在AA發(fā)病機(jī)制中的作用，尋找AA治療的新靶點(diǎn)。觀察AA患者端粒長度與IST治療療效的關(guān)系，了解AA患者的端粒長度對于評估常規(guī)IST治療療效及預(yù)后的意義，為其盡早選擇合適的治療方案提供理論依據(jù)。
　　 方法:(1)研究對象，選取2010年9月至2013年3月廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院、廣州市第一人民醫(yī)院、廣州市第十二人民醫(yī)院、廣東藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院、中山大

8、學(xué)附屬第一醫(yī)院等多家醫(yī)院血液科確診的71例AA患者，男性36例，女性35例，平均年齡39.48±18.78歲（12-82歲），其中NSAA組35例，SAA組26例，VSAA組10例，于初診時留取外周血標(biāo)本3ml(EDTA)。同時選取性別及年齡與之匹配的34例門診健康體檢者作為正常對照組，其中男性17例，女性17例，平均年齡40.68±19.00歲（10-73歲），亦留取外周血標(biāo)本3ml(EDTA)。IST標(biāo)準(zhǔn)方案為ATG聯(lián)合CSA。診斷

9、及療效標(biāo)準(zhǔn)參考2009年英國再生障礙性貧血診療指南，本研究取得患者本人或其家屬的同意并簽訂知情同意書。(2)采用流式-原位雜交法(Flow-FISH)檢測相對端粒長度，培養(yǎng)MOLT-4細(xì)胞株做內(nèi)對照細(xì)胞，被檢測標(biāo)本分別于含F(xiàn)ITC-PNA探針和不含F(xiàn)ITC-PNA探針的雜交液混合雜交，經(jīng)孵育、洗滌、染色后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測端粒長度，端粒長度以待測外周血單個核細(xì)胞標(biāo)本相對于同批上機(jī)的MOLT-4內(nèi)對照細(xì)胞株的平均熒光強(qiáng)度的百分比值表示，根

10、據(jù)公式計(jì)算相對端粒長度(relative telomere length，RTL)=（帶FITC-PNA探針樣品細(xì)胞的平均FL1值—不帶FITC-PNA探針樣品細(xì)胞的平均FL1值）×對照細(xì)胞的DNA指數(shù)×l00/(帶FITC-PNA探針對照細(xì)胞的平均FL1值—不帶FITC-PNA探針對照細(xì)胞的平均FL1值)×DNA樣品細(xì)胞的DNA指數(shù)。采用TRAP-PCR-ELISA法檢測AA患者的端粒酶活性，樣品相對端粒酶活性(RTA)，根據(jù)公式RT

11、A=(AS-AS0)/AS.IS/(ATS8-ATS8.0)/ATS8.IS*100，RTA＞0.2為端粒酶陽性，觀察AA患者PBMNC端粒長度與IST療效的關(guān)系。
　　 (3)應(yīng)用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以((x)±s)表示，多因素分析應(yīng)用線性回歸;多組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)方差不齊時采用近似F檢驗(yàn)Welch法;多重比較時方差齊采用LSD法，方差不齊采用Dunnett'T3。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較

12、采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果:(1)研究對象分為正常對照組、NSAA組及SAA+VSAA組。PBMNC端粒長度與相關(guān)因素的線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，不同性別者PBMNC端粒長度無顯著差別（t=0.548，P=0.585），性別與診斷的交互作用不顯著（t=-0.580，P=0.563），即各組中性別對外周血端粒長度均無顯著影響。(2)正常對照組、NSAA組及SAA+VSAA組中，外周

13、血端粒長度與年齡呈負(fù)相關(guān)(b=-0.387，P=0.001)，即都隨年齡的增長而縮短，而不同組間比較，正常對照組端粒長度隨年齡增長下降幅度要稍大于其他兩組（NSAA、SAA+VSAA組），NSAA組與SAA+VSAA組端粒長度隨年齡變化的趨勢一致。(3)控制了年齡對外周血端粒長度的影響，采用多重比較發(fā)現(xiàn)，NSAA、SAA+VSAA組外周血端粒長度均顯著短于正常對照組（P均＜0.001）。(4)端粒酶活性檢測對象選取NSAA組23例，SA

14、A+VSAA組28例，性別年齡與之匹配的34例正常對照組，分組檢測示34例正常對照組中端粒酶陽性6例(17.6％)，23例NSAA組中端粒酶陽性11例(47.8％)，28例SAA+VSAA組中端粒酶陽性21例(75.0％)。三組端粒酶活性有顯著差別(F=20.385，P＜0.001)。多重比較示SAA+VSAA組(P＜0.001)、NSAA組(P=0.002)端粒酶活性均顯著高于正常對照組，約為正常對照組端粒酶活性的2-3倍。隨機(jī)選取7

15、例，其中正常對照組2例，SAA患者5例，通過測序法檢測端粒酶TERT部分的6個突變位點(diǎn)，并根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫資料進(jìn)行序列對比，結(jié)果顯示檢測的7例標(biāo)本，均無突變。(5)71例AA患者經(jīng)過IST治療，35例NSAA組中完全有效組(CR)14例(40.0％)，部分有效組(PR)16例(45.7％)，無效組(NR)5例(14.3％);36例SAA+VSAA組中CR11例(30.6％)，PR16例(44.4％)，NR9例(25.0％)。(6)采用

16、方差分析和卡方檢驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，不同性別患者間的療效無顯著性差別(X2=2.3975，P=0.302)，NSAA組與SAA+VSAA組間療效無顯著性差別(X2=1.489，P=0.475)。而年齡對療效有影響(F=3.138，P=0.05)，鑒于P=0.05，采用線性回歸方程，調(diào)整了年齡對外周血端粒長度的影響，方差分析發(fā)現(xiàn)不同療效組與對照組間的外周血端粒長度有顯著性差別(F=4.615，P=0.003)，多重比較示，NR組的外周血端粒長度顯

17、著低于正常對照組(P=0.005)，PR、CR組跟正常對照組相比均無顯著差別(P=0.517，P=0.254)。當(dāng)AA患者PBMNC端粒長度低于界值點(diǎn)29.21時，將顯著影響IST療效，無效病例明顯增多。
　　 結(jié)論:AA患者PBMNC端粒長度與正常對照組相比顯著縮短，可直接導(dǎo)致其骨髓增殖能力降低，而與其低增生狀態(tài)不同的是，AA患者PBMNC端粒酶活性不低反而升高，且IST無效組的外周血端粒長度顯著低于正常對照組，這部分端粒及端