人端粒酶催化亞基反義RNA重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、[目的]
　　 病理性瘢痕包括增生性瘢痕與瘢痕疙瘩，其形成過程受到各種因素的影響。一般認(rèn)為它們是由創(chuàng)傷引起，以成纖維細(xì)胞的過度增生及膠原等大量細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生和沉積為特征的皮膚纖維增生性疾病。病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)理至今不甚清楚，但以往大量研究表明瘢痕的過度增生與細(xì)胞因子、癌基因和免疫反應(yīng)等密切相關(guān)。越來越多的研究表明人端粒酶催化亞基(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)具有逆

2、轉(zhuǎn)錄酶活性，在癌細(xì)胞或永生化細(xì)胞中高表達(dá)，是端粒酶活性的重要決定因素。重組腺病毒載體是目前應(yīng)用最廣泛的生物病毒載體之一，與其他病毒載體系統(tǒng)比較，具有明顯優(yōu)點(diǎn)：能將外源基因高效導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；其轉(zhuǎn)染不依賴細(xì)胞分裂，既可轉(zhuǎn)染分裂期細(xì)胞，又可轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞；攜帶的外源基因不與宿主基因整合，對(duì)人致病性低。這些優(yōu)點(diǎn)使其成為一種高效而安全的基因轉(zhuǎn)移工具，廣泛應(yīng)用于基因治療的研究。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建含有人端粒酶催化亞基中c-myc原癌基因結(jié)合位點(diǎn)的反義R

3、NA的重組腺病毒載體，為下一步轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，觀察hTERT在細(xì)胞中表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)的影響奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.按照人工合成中反向轉(zhuǎn)錄的方法設(shè)計(jì)基因合成引物，用復(fù)式PCR獲得目的片段ashTERT(322bp)。
　　 2.將片段ashTERT克隆到pUC57(2.7kb)克隆載體，然后熱激轉(zhuǎn)化到E.coli感受態(tài)細(xì)胞中，菌檢、PCR、鑒定陽(yáng)性克隆后，菌液放大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pUC57-

4、ashTERT，然后對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
　　 3.將目的基因片段亞克隆到穿梭載體pShuttle-CMVneo上，然后構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd-ashTERT。
　　 4.轉(zhuǎn)入293細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝、鑒定和滴度測(cè)定。
　　 [結(jié)果]
　　 1.應(yīng)用overlapping PCR獲得目的基因片段經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增片斷約為322bp，與目的片斷大小基本符合，且無非特異性擴(kuò)增。
　　 2.腺病

5、毒穿梭質(zhì)粒pUC57-ashTERT經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnI酶切后電泳見大約307bp片段，與目的片斷符合，再連接到pShuttle-CMVneo穿梭載體上熱激轉(zhuǎn)化克隆后提取質(zhì)粒pShuttle-ashTERT，測(cè)序結(jié)果表明克隆得到的序列符合設(shè)計(jì)要求。
　　 3.同源重組腺病毒質(zhì)粒pAd-ashTERT經(jīng)PacI酶切后電泳，可見約30kb的大片段和約4.5kb或3.0kb的小片段。
　　 4.重組腺病毒質(zhì)粒pAd-ashT