雞端粒酶催化亞基活性中心的克隆與生物信息學(xué)分析.pdf

1、端粒酶(Telomerase)是真核細(xì)胞中的一種核糖核蛋白復(fù)合體，由端粒酶RNA組分(Telomerase RNA，TR)和端粒酶催化亞基(Telomerase Reverse Transcriptase，TERT)組成，是一種特殊的DNA聚合酶，具有延伸DNA末端的功能，能夠維持端粒的長度和功能，TR為端粒的合成提供模板，TERT具有反轉(zhuǎn)錄酶活性。在大多數(shù)體細(xì)胞和原代細(xì)胞中，無端粒酶活性或活性很低，但在腫瘤細(xì)胞中，端粒酶活性卻被激活，

2、這是維持細(xì)胞分裂及克服端粒序列不斷丟失所必須的。本研究對(duì)雞端粒酶(chicken TERT，chTERT)活性中心進(jìn)行預(yù)測(cè)定位、克隆測(cè)序以及生物信息學(xué)分析，擬在探討MD腫瘤發(fā)生與端粒及端粒酶的關(guān)系，從而為病毒性腫瘤發(fā)生的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 通過chTERT全序列與人hTERT(human TERT，hTERT)活性中心序列的序列比對(duì)和同源性分析，結(jié)果表明，雞原腸胚期細(xì)胞(Gastrula Stage Cell，GSC)chTER

3、T保守區(qū)序列位于chTERT序列全長的2013bp-3825bp處，全長1813bp，chTERT序列包括反轉(zhuǎn)錄基序1、2、A、B、C、D、E；chTERT活性中心區(qū)域位于保守區(qū)2301bp-3825bp，全長1525bp。采用RT-PCR技術(shù)，分別對(duì)GSC和雞馬立克氏病淋巴樣瘤細(xì)胞系MDCC-MSB1(Marek’s Disease Virus Trarlsformed Chickerl Lymphoblastoid Cells-MS

4、B1 line)chTERT保守區(qū)序列進(jìn)行了克隆與序列分析。結(jié)果表明，GSC的chTERT包括活性中心的保守區(qū)序列，全長1813bp(NCBI收錄號(hào)EF552224)；MDCC-MSB1的chTERT包括活性中心的保守區(qū)序列，全長1543bp(NCBI收錄號(hào)EF552225)，但在MDCC-MSBl的chTERT保守區(qū)序列中與GSC的chTERT保守區(qū)序列比對(duì)，出現(xiàn)兩部分的缺失現(xiàn)象，缺失A位置位于保守區(qū)全長1813bp的612bp-79

5、1bp，長度180bp;缺失B位置位于1053bp-1134bp，長度82bp。 根據(jù)獲得的雞端粒酶催化亞基保守區(qū)序列的信息，利用生物信息學(xué)方法，應(yīng)用ExPASy與NCBI等系統(tǒng)中的生物信息學(xué)分析工具，對(duì)雞端粒酶催化亞基保守區(qū)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分析和預(yù)測(cè)結(jié)果獲得如下目的基因的氨基酸序列及其各項(xiàng)理化參數(shù)，包括分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成及電荷分布等。二級(jí)結(jié)構(gòu)如α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，各結(jié)構(gòu)單元在氨基酸

6、序列中的分布，這些結(jié)果對(duì)chTERT活性中心的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能的研究提供參考。 利用多重序列比對(duì)工具，對(duì)chTERT與不同物種的來源的動(dòng)物TERT進(jìn)行了同源性分析，結(jié)果顯示它們之間核苷酸的同源性不高，但氨基酸序列間的比對(duì)結(jié)果顯示有較高的同源性，在酶的活性中心部位，氨基酸序列有相似反轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase，RT)基序，存在著保守序列。利用BLAST比對(duì)工具，對(duì)克隆片段的缺失部分進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果