擬南芥AtDPBF4基因克隆、生物信息學(xué)分析與表達(dá)研究.pdf

1、逆境條件下逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)功能基因的表達(dá)，已經(jīng)是眾所周知的事情，由此轉(zhuǎn)錄因子的研究成為許多研究人員的一個新的課題，以期在基因轉(zhuǎn)錄水平上闡述干旱、耐鹽堿等作用機(jī)理，本論文以擬南芥為研究對象，克隆轉(zhuǎn)錄因子ABI5家族中最小成員AtDPBF4基因，并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到純化的目的蛋白，這對于研究該蛋白的生理學(xué)功能具有重要意義，從而為進(jìn)一步研究AtDPBF4基因在擬南芥生長發(fā)育調(diào)控過程中發(fā)揮的作用奠定

2、研究基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1) AtDPBF4基因的分子克隆:以NCBI數(shù)據(jù)庫中的擬南芥DPBF4基因的cDNA序列為參考序列，結(jié)合后期表達(dá)載體pET-32a的序列特征，設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，用高保真DNA聚合酶通過RT-PCR的方法擴(kuò)增得到了AtDPBF4基因。將其與克隆載體pMD-T Vector連接，得到重組質(zhì)粒pM-AtDPBF4。經(jīng)測序結(jié)果表明克隆得到的AtDPBF4基因全長789bp，總共編碼263個

3、氨基酸。
　　(2)對AtDPBF4基因序列編碼的氨基酸的理化性質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)定位、保守結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。并基于NCBI數(shù)據(jù)庫中與其同源性很高的序列構(gòu)建了基因進(jìn)化樹。結(jié)果表明:該基因可編碼一條理論分子質(zhì)量為29.19 kD的氨基酸，并由14個α螺旋、6個β折疊、1個β轉(zhuǎn)角和10個無規(guī)卷曲組成的二級結(jié)構(gòu)，在188-260氨基酸之間是一個BRLZ結(jié)構(gòu)域，包含一個鋅指結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)域在DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起作用，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該

4、蛋白質(zhì)在空間主要以α螺旋存在。采用近鄰結(jié)合法(neighbor-joining)將NCBI中與AtDPBF4同源性大于95％以上的部分序列構(gòu)建進(jìn)化樹，顯示該基因都屬于ABI家族。
　　(3) AtDPBF4基因原核表達(dá)載體的體外構(gòu)建及原核表達(dá):對質(zhì)粒pET-32a和重組質(zhì)粒pM-AtDPBF4用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NcoⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)體外連接構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-AtDPBF4，選擇BL21(DE3)作為宿主細(xì)胞進(jìn)行