柚果實黃酮合成相關基因cDNA克隆及生物信息學分析.pdf

1、本研究利用RT-PCR和RACE技術，克隆了‘琯溪蜜柚’果實中黃烷酮-3-羥化酶(F3H)的cDNA全長以及查爾酮合成異構酶(CHI)，查爾酮合成酶(CHS)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)cDNA的保守序列。這些類黃酮合成關鍵基因的克隆，為柚子果實類黃酮合成機理研究奠定了分子生物學基礎。研究結果如下：
　　 1．利用RT-PCR和RACE進行F3H cDNA全長的克隆
　　 F3HcDNA全長為1302bp，開放閱讀框能夠編

2、碼362個氨基酸（Mw=40.497kDa,pI=5.97）。利用NCBI進行基因和蛋白質Blast，結果發(fā)現(xiàn)F3H的cDNA全長，該序列與柳橙(Citrus sinensis)、龍眼(Dimocarpus longan)、陸地棉(Gossypium barbadense)、海島棉(Gossypium hirsutum)、葡萄(Vitisvinifera)同源性也比較高，分別為97％、87％、86％、85％、84％；蛋白質序列與柳橙(C

3、itrus sinensis)、龍眼(Dimocarpus longan)、陸地棉(Gossypium barbadense)、海島棉(Gossypium hirsutum)、葡萄Vitisvinifera)同源性也比較高，分別為97％、87％、86％、85％、84％。對克隆基因編碼蛋白質保守序列的預測，該基因包括20G-FeⅡ-Oxy高度保守區(qū)域，該結構域具有賴氨酸水解酶、異青霉素合成酶和AlkB活性，該保守結構決定了該酶具有催化類黃

4、酮合成的功能。該序列的GenBank登錄號為：GQ121373。
　　 2．利用RT-PCR和RACE進行CHI cDNA保守序列的克隆
　　 克隆得到CHI基因的cDNA保守片段，長度782bp，利用Blast比對軟件，發(fā)現(xiàn)‘琯溪蜜柚’果實的CHI基因與甜橙(Citrus sinensis)、溫州蜜柑家族(Citrus reticulata) CHI的cDNA基因同源性很高，達到96％、95％，與毛果楊(Populus

5、 trichocarpa)、西洋梨子(Damson pear)、草莓(Fragaria ananassa)、圓葉牽牛(Ipomoea purpurea)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)的cDNA的同源率分別為79％、78％、77％、74％、68％。編碼蛋白質的保守序列發(fā)現(xiàn)，該基因具有Chalcone superfamily的保守序列，該保守序列與CHI基因催化類黃酮物質的合成有關。該序列的GenBank登錄號為：FJ

6、976039。
　　 3．利用RT-PCR進行CHS cDNA保守序列的克隆
　　 克隆得到一段長280bp的CHS基因的保守序列，該基因與野茶樹的CHS基因具有較高的同源性，推測編碼蛋白質保守結構域為cond-enzymes家族，屬于縮合酶家族，催化類似于重排（脫羧基或者非脫羧基）反應的酶促反應。這個家族有很強的結構相似性，也參與脂肪酸的合成和降解反應，產(chǎn)生聚酮化合物。在類黃酮物質的合成過程中，CHS的主要功能是催化從

7、4-香豆酸CoA和丙二酰CoA合成查爾酮的酶促反應。該序列的GenBank登錄號為：GU932717。
　　 4．利用RT-PCR進行PAL cDNA保守序列的克隆
　　 克隆得到一段長875bp的PAL基因的保守序列。通過與其他植物PAL基因的比對，發(fā)現(xiàn)與其他一些植物具有較高的同源性。預測該基因編碼的蛋白質具有一個保守結構域PAL-HAL，該結構域能催化苯基丙氨酸形成苯丙烯酸。該序列的GenBank登錄號為：GQ125