柚果實(shí)黃酮合成相關(guān)基因cDNA克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆了‘琯溪蜜柚’果實(shí)中黃烷酮-3-羥化酶(F3H)的cDNA全長以及查爾酮合成異構(gòu)酶(CHI)，查爾酮合成酶(CHS)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)cDNA的保守序列。這些類黃酮合成關(guān)鍵基因的克隆，為柚子果實(shí)類黃酮合成機(jī)理研究奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：
　　 1．利用RT-PCR和RACE進(jìn)行F3H cDNA全長的克隆
　　 F3HcDNA全長為1302bp，開放閱讀框能夠編

2、碼362個(gè)氨基酸（Mw=40.497kDa,pI=5.97）。利用NCBI進(jìn)行基因和蛋白質(zhì)Blast，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F3H的cDNA全長，該序列與柳橙(Citrus sinensis)、龍眼(Dimocarpus longan)、陸地棉(Gossypium barbadense)、海島棉(Gossypium hirsutum)、葡萄(Vitisvinifera)同源性也比較高，分別為97％、87％、86％、85％、84％；蛋白質(zhì)序列與柳橙(C

3、itrus sinensis)、龍眼(Dimocarpus longan)、陸地棉(Gossypium barbadense)、海島棉(Gossypium hirsutum)、葡萄Vitisvinifera)同源性也比較高，分別為97％、87％、86％、85％、84％。對克隆基因編碼蛋白質(zhì)保守序列的預(yù)測，該基因包括20G-FeⅡ-Oxy高度保守區(qū)域，該結(jié)構(gòu)域具有賴氨酸水解酶、異青霉素合成酶和AlkB活性，該保守結(jié)構(gòu)決定了該酶具有催化類黃

4、酮合成的功能。該序列的GenBank登錄號為：GQ121373。
　　 2．利用RT-PCR和RACE進(jìn)行CHI cDNA保守序列的克隆
　　 克隆得到CHI基因的cDNA保守片段，長度782bp，利用Blast比對軟件，發(fā)現(xiàn)‘琯溪蜜柚’果實(shí)的CHI基因與甜橙(Citrus sinensis)、溫州蜜柑家族(Citrus reticulata) CHI的cDNA基因同源性很高，達(dá)到96％、95％，與毛果楊(Populus

5、 trichocarpa)、西洋梨子(Damson pear)、草莓(Fragaria ananassa)、圓葉牽牛(Ipomoea purpurea)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)的cDNA的同源率分別為79％、78％、77％、74％、68％。編碼蛋白質(zhì)的保守序列發(fā)現(xiàn)，該基因具有Chalcone superfamily的保守序列，該保守序列與CHI基因催化類黃酮物質(zhì)的合成有關(guān)。該序列的GenBank登錄號為：FJ

6、976039。
　　 3．利用RT-PCR進(jìn)行CHS cDNA保守序列的克隆
　　 克隆得到一段長280bp的CHS基因的保守序列，該基因與野茶樹的CHS基因具有較高的同源性，推測編碼蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域?yàn)閏ond-enzymes家族，屬于縮合酶家族，催化類似于重排（脫羧基或者非脫羧基）反應(yīng)的酶促反應(yīng)。這個(gè)家族有很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)相似性，也參與脂肪酸的合成和降解反應(yīng)，產(chǎn)生聚酮化合物。在類黃酮物質(zhì)的合成過程中，CHS的主要功能是催化從

7、4-香豆酸CoA和丙二酰CoA合成查爾酮的酶促反應(yīng)。該序列的GenBank登錄號為：GU932717。
　　 4．利用RT-PCR進(jìn)行PAL cDNA保守序列的克隆
　　 克隆得到一段長875bp的PAL基因的保守序列。通過與其他植物PAL基因的比對，發(fā)現(xiàn)與其他一些植物具有較高的同源性。預(yù)測該基因編碼的蛋白質(zhì)具有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域PAL-HAL，該結(jié)構(gòu)域能催化苯基丙氨酸形成苯丙烯酸。該序列的GenBank登錄號為：GQ125