帕金森病相關基因的篩選及生物信息學分析.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease，PD)是中老年人常見的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，是我國第二大神經退行性疾病，其發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病，帕金森病的病理改變是中腦黑質多巴胺（dopamine，DA）能神經元變性、胞漿內Lewy小體的形成，使黑質紋狀體通路破壞及尾狀核、殼核中DA含量減少。其主要的臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、行動遲緩和姿勢步態(tài)異常。隨著人們對該病的認識，發(fā)現(xiàn)全世界PD的發(fā)病人數(shù)逐年增多，加之人口的老齡化，其

2、患病率呈上升趨勢。國內外流行病學研究表明:65歲以上人群中發(fā)病率是1～2％，85歲以上高達4～5％，55歲以上PD患者總人數(shù)已超過170萬人。隨著社會人口的自然老齡化，PD的患病人數(shù)逐年增加，我國的患病人數(shù)已超過200萬。近年來的研究發(fā)現(xiàn)嗅覺障礙、睡眠障礙、精神障礙、認知障礙，以及自主神經功能障礙等普遍存在于PD患者中，而且出現(xiàn)在運動癥狀的不同時期，同樣影響著患者的生存質量。PD雖然不會縮短患者壽命，但與阿爾茨海默病(Alzheimer

3、'sDisease，AD)一樣嚴重影響患者的生存質量，以及因其病程長、致殘率高等特點，給患者和家庭帶來沉重的負擔及煩惱。因此，研究帕金森病的病因和發(fā)病機制具有極其重要的意義。
　　帕金森病的病因和發(fā)病機制尚不清楚，目前認為是在年齡老化的背景上，遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結果。許多研究提示PD患者黑質DA能神經元變性可能與線粒體功能障礙、氧化應激、興奮性毒性、神經營養(yǎng)因子缺乏、免疫調節(jié)異常、細胞調亡等一系列機制、環(huán)節(jié)有關，流行病學

4、調查研究顯示，約有10～15％的帕金森病患者有家族史。通過對遺傳因素在PD發(fā)病中的作用機理研究，目前至少克隆了13個PD致病基因，表明帕金森病的發(fā)病與遺傳因素密切相關，而遺傳因素包含了多基因、多因子的相互作用和影響。因而從分子水平研究帕金森病的發(fā)生發(fā)展，對于它的預防、控制和治療具有重要意義。
　　微小RNA(microRNA，miRNAs)是一類在細胞中高度保守的、內源性非編碼、長度約22～25核苷酸(nt)的單鏈小RNA分子。由

5、一段長度為70-80nt并具有發(fā)夾環(huán)結構的單鏈miRNA前體剪切后生成。其廣泛存在于真核生物中，主要是與靶mRNA的3'端非翻譯調控區(qū)（3'-untransltated region，3'UTR）互補或者部分互補結合，使其降解或介導翻譯抑制，從而在轉錄后水平調節(jié)基因的表達，具有組織和時間的特異性，是調節(jié)其他功能基因表達的重要調控分子。miRNAs參與了生命過程中的許多重要事件，如胚胎的早期發(fā)育、細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡以及代謝、腫瘤

6、轉移等。
　　基因芯片是20世紀90年代中期以來隨著人類基因組計劃快速發(fā)展起來的分子生物學高新技術，已廣泛應用于疾病基因表達譜分析、尋找疾病相關基因、藥物作用靶標、腫瘤預后、復雜疾病的致病機制分析等方面，為個體化診斷和治療提供指導，也可以揭示基因間的表達調控關系，同時它在制藥和臨床研究中也有重要的作用。基因芯片提供了包括基因功能、基因相互作用等海量信息，這些數(shù)據為功能基因組研究提供了重要的資源，GEO、SMD、ArrayExpre

7、ss等數(shù)據庫在基因芯片的歸類、儲存、資源共享等方面提供有利幫助。數(shù)據是知識和信息的重要來源，對于這些數(shù)據已經無法通過簡單的計算和分析來進行，因此，如何采用一些新的方法和技術來有效分析這些龐大的基因芯片，并從中挖掘和揭示蘊藏的、有意義的生物學信息，是當前基因芯片領域亟待解決的重要課題。
　　生物信息學(Bioinformatics)是伴隨著人類基因組計劃發(fā)展而產生的一門涉及生物學、數(shù)學以及計算機科學的交叉學科。生物信息學是融合生命科

8、學與數(shù)理科學的新興學科，具體地說生物信息學是以核酸、蛋白質等生物大分子數(shù)據庫為主要研究對象，以數(shù)學、信息學、計算機科學為主要研究手段，對海量的原始數(shù)據進行存儲、管理、注釋、加工。
　　隨著近年來生物實驗方法和檢測數(shù)據的發(fā)展，積累了大量分子生物學實驗數(shù)據，通過對這些數(shù)據的分類、收集、整理，產生了成千上萬的數(shù)據庫。數(shù)據庫是生物信息學的主要內容，各種數(shù)據庫幾乎覆蓋了生命科學的各個領域。常用的有核酸和蛋白質數(shù)據庫，如NCBI的核酸序列數(shù)據

9、庫、蛋白質數(shù)據庫(UniProt)等;基因芯片數(shù)據庫，如高通量基因表達數(shù)據庫(GEO);疾病相關數(shù)據庫，如GeneCards(基因卡片)、藥物和疾病數(shù)據庫(DrugBank)等。目前，生物信息學已廣泛地滲透到生命科學的各個研究領域中，成為不可或缺的重要工具，在人類疾病與功能基因的發(fā)現(xiàn)、識別，基因與蛋白質的功能研究方面都發(fā)揮著關鍵的作用，如基因表達調控、疾病相關基因鑒定、基因產物結構與功能預測、癌癥的遺傳機制研究等。
　　本研究以G

10、EO數(shù)據庫中關于帕金森病的基因表達譜數(shù)據和microRNA表達譜數(shù)據為分析材料，利用Qlucore Omics Explorer3.0軟件篩選基因表達譜數(shù)據GSE22491（帕金森病樣本10例，正常對照組樣本8例）的差異表達基因和miRNA表達譜數(shù)據GSE16658（帕金森病樣本19例，正常對照組樣本13例）的差異表達miRNA，通過miRecords預測差異miRNA的靶基因，利用DAVID、KEGG、STRING等在線分析軟件對數(shù)據

11、集GSE22491差異基因和數(shù)據集GSE16658差異miRNA靶基因進行生物信息學分析，為帕金森病的分子發(fā)病機制、藥物研發(fā)及治療提供有意義的探索和依據。
　　根據設定的數(shù)值過濾標準和中位值標準化處理后，基因表達譜數(shù)據GSE22491經QOE3.0軟件篩選出1752個差異基因，其中上調1561個，下調191個。通過DAVID生物學過程分析表明，差異表達的基因主要涉及蛋白質的翻譯、翻譯延伸、代謝前體、信使核糖核酸代謝過程、電子傳遞鏈

12、、RNA和mRNA的修飾、泛素依賴蛋白酶體促進蛋白質分解代謝、泛素蛋白連接酶對有絲分裂過程中細胞周期的負調控過程等;分子功能表明，差異表達的基因主要涉及核糖體的結構成分、RNA復合物、活性結構分子、作用于NADH或NADPH的氧化還原酶活性，NADH脫氫酶活性、氫離子跨膜轉運活性、氧化還原酶活性，作用于NADH或NADPH醌或類似化合物受體、陽離子跨膜轉運活性等。通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些差異基因主要參與核糖體信號通路、帕金森病信號通路

13、、氧化磷酸化信號通路、亨廷頓病信號通路、阿爾茨海默病信號通路、蛋白酶體信號通路、心臟肌肉收縮信號通路、卵母細胞減數(shù)分裂信號、霍亂弧菌感染信號通路、白細胞跨內皮遷移信號通路、磷酸戊糖途徑信號通路、檸檬酸信號通路、FcγR介導的吞噬通路等。通過QOE3.0軟件的進一步篩選得到101個差異表達比較大的基因，將這101個基因上傳至STRING在線工具，分析這些基因編碼的蛋白質間的相互作用，結果顯示整個網絡以SKP2、ACTC6A、RBX1、BU

14、C、SMARCD1、SKP1、CUL1、BTRC、SMARCC1、SMAP CA4、CDK2、CUL4A、TAF4、CTNNB1、FBXW11蛋白與其他≥10個蛋白存在相互作用關系，為此蛋白相互作用網絡的中心節(jié)點，刪除這些節(jié)點蛋白后，網絡結構渙散。這些基因在不同的癌癥發(fā)生發(fā)展的作用都有文獻報道，其中SKP2、RBX1、SKP1、CUL1、CUL4A與泛素蛋白酶都有緊密的聯(lián)系，泛素蛋白酶在PD的發(fā)病機制中可能發(fā)揮著重要的作用，這些基因也可

15、能作為PD潛在的治療靶點。
　　miRNA表達譜數(shù)據GSE16658經QOE3.0軟件篩選出46個差異表達miRNA，其中上調5個，下調41個。通過miRecords對差異表達的miRNA進行靶基因預測獲得靶基因50個，經DAVID對這些靶基因生物學過程分析表明，這些靶基因主要涉及細胞增殖調節(jié)、RNA代謝調節(jié)、轉錄調節(jié)、造血作用、免疫系統(tǒng)發(fā)展、淋巴器官發(fā)展等;分子功能表明，這些靶基因主要涉及細胞外基質的結構組成、血小板源生長因子、

16、結構活性分子、結合生長因子、結合SMAD、甲基化轉移酶活性、結合啟動子等。通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些靶基因主要參與ECM相互作用受體信號通路、VEGF信號通路、TGF轉化因子信號通路、白細胞跨內皮轉移信號通路等。將這50個靶基因上傳至STRING在線工具，分析這些基因編碼的蛋白質間的相互作用，結果顯示整個網絡以ESR1、CCND1、HDAC4、MYCN、E2F3、CDKN1B、CDK6、SP1、MYB、DNMT3A、DNMT3B、COL

17、1A1、COL1 A2、COL1A1、COL4A1蛋白與其他≥10個蛋白存在相互作用關系，為此蛋白相互作用網絡的中心節(jié)點，刪除這些節(jié)點蛋白后，網絡結構渙散，這些基因可能是PD的關鍵靶基因。這些靶基因有很大部分是miRNA-30b，miRNA-30c，miRNA-26a的靶基因，而這三個miRNA在神經元和神經膠質細胞中大量表達，說明這三個miRNA可能是帕金森病潛在的生物標志物。
　　綜上所述，本研究利用生物信息學的方法分別分析了