鵝源糞腸球菌efaA基因的克隆表達(dá)和生物信息學(xué)分析.pdf

1、目的:構(gòu)建鵝源糞腸球菌efaA基因的原核表達(dá)載體，在大腸球菌工程菌BL21中表達(dá)，對(duì)所表達(dá)的efaA蛋白進(jìn)行免疫原性檢測(cè)及生物信息學(xué)分析。
　　方法:提取糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株與分離株的總DNA，做擴(kuò)增模板;登陸GenBank，根據(jù)其公布的糞腸球菌心內(nèi)膜炎抗原的堿基序列，應(yīng)用PrimerPremier5.0與Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)efaA的特異性引物;摸索PCR擴(kuò)增條件擴(kuò)增成功后，進(jìn)行凝膠電泳分離并回收目的片段;將該片段與pMD18

2、-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞;篩選陽(yáng)性克隆菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和單雙酶切鑒定，確證克隆成功后送公司測(cè)序。酶切克隆成功的pMD18-T-efaA重組質(zhì)粒，構(gòu)建pET-28a-efaA重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中;篩選pET-28a-efaA/BL21陽(yáng)性菌株，分別在不同濃度、時(shí)間及溫度條件下誘導(dǎo)表達(dá)，確定最佳誘導(dǎo)條件;通過(guò)蛋白電泳SDS-PAGE鑒定確證后，用鎳柱純化，得到純化的efaA蛋白。用

3、SDS-PAGE和Westernblot兩種方法鑒定efaA蛋白。對(duì)表達(dá)的efaA氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析:根據(jù)對(duì)efaA氨基酸組分、分子質(zhì)量、滴定曲線(xiàn)與等電點(diǎn)等分析，預(yù)測(cè)其一級(jí)結(jié)構(gòu)中糖基化位點(diǎn)等，根據(jù)對(duì)其可塑性、親水性、抗原性指數(shù)和表面可及性以及β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲等的綜合分析，預(yù)測(cè)潛在抗原表位。
　　結(jié)果:成功克隆了鵝源糞腸球菌菌株心內(nèi)膜炎抗原efaA基因，其堿基序列為726bp，編碼242個(gè)氨基酸。成功構(gòu)建了pET-28

4、a-efaA/BL21表達(dá)載體，確定最佳誘導(dǎo)條件為，IPTG終濃度1.0mmol/L、溫度28℃、時(shí)間4h，所表達(dá)的蛋白為30KD，大小與預(yù)期一致。SDS-PAGE和Westernblot鑒定，efaA蛋白為30KD，與預(yù)期一致。鵝源糞腸球菌efaA蛋白的第13～19、26～33、66～73、92～105、141～149、152～164、190～200、210～260位氨基酸，其親水性指數(shù)＞0、AI≥0、表面可及性＞1，具有β-折疊和無(wú)