桑樹(shù)苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC4.3.1.5)是連接植物初級(jí)代謝和苯丙烷類(lèi)代謝、催化苯丙烷類(lèi)代謝第一步反應(yīng)的酶，是苯丙烷類(lèi)代謝途徑中研究最多的酶，也是苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，并且與植物的抗逆性直接相關(guān)。 桑樹(shù)(Morus alba L.)是一種重要的多年生經(jīng)濟(jì)林木，桑葉是桑蠶的主要食物來(lái)源，桑葉的產(chǎn)量和質(zhì)量直接影響蠶繭的產(chǎn)量和質(zhì)量。依靠常規(guī)的育種方法和栽培措施的改善，已很

2、難使桑葉的產(chǎn)量和質(zhì)量有明顯的提高，利用基因工程技術(shù)改良桑樹(shù)品質(zhì)是當(dāng)今桑樹(shù)育種的新方向。苯丙氨酸解氨酶是木質(zhì)素代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，與植物的抗病性直接相關(guān)。因此若能在桑樹(shù)中高效表達(dá)此基因，可極大的提高桑樹(shù)的抗逆性，改良桑葉的品質(zhì)。因此，開(kāi)展桑樹(shù)苯丙氨酸解氨酶的分子生物學(xué)研究具有十分重要的意義。 本研究以沙2×倫教109雜交桑苗的葉片為材料，利用同源克隆方法成功克隆出pal1和pal2部分cDNA片斷，并進(jìn)行了序列分析。主要研究結(jié)果

3、如下： 1.本文用改良CTAB法提取其總RNA，電泳檢測(cè)RNA條帶完整、亮度高，RNA提取周期短，應(yīng)用改進(jìn)的LiCl沉淀RNA方法，僅需10 min。用該法提取的RNA純度高，能用于分子克隆等后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。 2.首次從桑樹(shù)葉片中擴(kuò)增得到兩個(gè)PAL基因片段，長(zhǎng)度分別為551bp和1105bp，分別編碼181個(gè)和367個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)依次為FJ938355和FJ938356。通過(guò)和Genbank核酸序列庫(kù)

4、中發(fā)表的紫花苜蓿(Medicago sativa)，榆樹(shù)(Ulmus pumila)，煙草(Nicotiana attenuate)，甜櫻桃(Prunus avium)等PAL的cDNA比較，同源性在69％-88％之間，表明所擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段即為PAL基因片段的一部分。 3.運(yùn)用在線Motiff分析系統(tǒng)，得知獲得的PAL1氨基酸序列10-15區(qū)域GLISSR為PAL的活性位點(diǎn)，屬于植物PAL的特征序列；PAL2氨基酸序列34

5、-50區(qū)域GTVTASGDLVPLSYIAG為PAL的活性位點(diǎn)，屬于植物PAL的特征序列，進(jìn)一步驗(yàn)證了所得序列均為PAL序列。采用最新的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線分析系統(tǒng)，對(duì)PAL2的氨基酸序列進(jìn)行在線分析，得知該段區(qū)域主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。 4.擴(kuò)增出桑樹(shù)未知基因3'端一個(gè)，長(zhǎng)664.bp，在531 bp處有TGA終止密碼子，在650 bp處有個(gè)多聚腺苷酸加尾信號(hào)，編碼176個(gè)通讀的蛋白質(zhì)氨基酸序列。同楊樹(shù)、葡萄的氨基酸序列