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1、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL,EC4.3.1.5),主要催化L一苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸,為多種酚類及類黃酮終產(chǎn)物提供前體物質(zhì),是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類次級(jí)代謝第一步反應(yīng)的酶,也是關(guān)鍵酶和限速酶。通過(guò)這一途徑可以產(chǎn)生多種具有重要生理功能的次生代謝物質(zhì),如花色素、木質(zhì)素、植保素等,這些物質(zhì)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病、抗逆反應(yīng)中起著重要的作用。
本研究對(duì)大豆PAL基因(GmPAL
2、)進(jìn)行克隆,并在此基礎(chǔ)上利用生物信息學(xué)手段對(duì)大豆PAL基因家族的兩個(gè)成員GmPAL1和GmPAL2推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行主要結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測(cè),主要研究結(jié)果如下:
1運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)首次克隆了大豆苯丙氨酸解氨酶基因GmPAL2(GenBank accessionnumber:GQ358921)。測(cè)序結(jié)果表明,GmPAL2基因組DNA長(zhǎng)度為4210bp,含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。與此同時(shí)克隆了已知的GmPAL1基因組DN
3、A,測(cè)序表明其長(zhǎng)度為3658bp,和大多數(shù)PAL基因一樣包含兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。
2利用RT-PCR方法成功地從大豆中克隆了已知的苯丙氨酸解氨酶基因GmPAL1mRNA(GenBank accession number:X52953)和未知的GmPAL2 mRNA(GenBank accession number:GQ220305)。獲得的GmPAL1cDNA基因長(zhǎng)度為2144bp,該基因可編碼712個(gè)氨基酸,其推導(dǎo)出
4、的氨基酸序列與其它植物PAL基因的具有較高的同源性。獲得的GmPAL2CDNA基因長(zhǎng)度為2284b,該基因可編碼717個(gè)氨基酸,而且其推導(dǎo)出的氨基酸序列與其它植物PAL基因的也具有較高的同源性。
3用ExPasy軟件包和TOPPRED在線分析GmPAL的理化特性,結(jié)果表明GmPAL1的理論等電點(diǎn)PI=6.14,蛋白質(zhì)相對(duì)分子量Mw=77.715kDa:GmPAL2的理論等電點(diǎn)PI=5.83,蛋白質(zhì)相對(duì)分子量Mw=78.11
5、6kDa。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,GmPAL1的α螺旋在49.09%左右,延伸鏈在7.11%左右,無(wú)規(guī)則卷曲在43.79左右;GmPAL2的α螺旋在48.46%左右,延伸鏈在6.46%左右,無(wú)規(guī)則卷曲在45.08左右,表明PAL為混合型蛋白。
運(yùn)用MEGA2.0軟件構(gòu)建了GmPAL的系統(tǒng)進(jìn)化樹,GmPAL和豌豆(Pisum sativum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)的同源性很近。
4運(yùn)用在線
6、Motiff分析系統(tǒng),得知推測(cè)的PAL1氨基酸序列的194-210區(qū)域和PAL2氨基酸序列的199-215區(qū)域的GTITASGDLvPLSyiaG為PAL的活性位點(diǎn),屬于植物PAL的特征序列,進(jìn)一步驗(yàn)證了所得序列均為PAL序列。
啟動(dòng)子(promoter)是RNA聚合酶能夠識(shí)別并與之結(jié)合,從而起始基因轉(zhuǎn)錄的序列,作為轉(zhuǎn)錄水平上一種重要的調(diào)控元件,研究啟動(dòng)子,對(duì)我們了解生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,探討生物對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制以及更
7、好地控制外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)等具有重要意義。
本研究取得的主要結(jié)果如下:
應(yīng)用RAIL-PCR技術(shù),克隆獲得了大豆PAL1和PAL2的上游啟動(dòng)子區(qū),分別為2509bp和1384bp。對(duì)獲得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了多個(gè)CART-box和TATA-box。TATA框具有將RNA聚合酶Ⅱ引導(dǎo)到正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的功能,CART框主要控制著轉(zhuǎn)錄的起始頻率,是調(diào)控轉(zhuǎn)錄速率的元件,與啟動(dòng)子的特異性無(wú)直接的關(guān)系
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