淋病奈瑟菌CRISPR系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析與克隆.pdf

1、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)，俗稱淋球菌，是性傳播疾病淋病(Gonorrhea)的病原菌，只感染人類，可導(dǎo)致男性急性尿道炎、女性尿道炎、子宮頸炎、新生兒淋菌性急性結(jié)膜炎等。人對(duì)淋病奈瑟菌普遍易感，感染后不能產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答，可反復(fù)感染。
　　成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeat，CRISPR)是近年發(fā)現(xiàn)

2、的細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)，由不連續(xù)的重復(fù)序列(Repeat)與間區(qū)序列(Spacer)間隔交替排列而成的CRISPR簇、前導(dǎo)序列以及一系列CRISPR相關(guān)蛋白基因(cas)構(gòu)成。CRISPR系統(tǒng)可抵抗噬菌體或質(zhì)粒等外源核酸對(duì)細(xì)菌的再次侵染。我們?cè)贑RISPR數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索發(fā)現(xiàn)，目前已有3株淋病奈瑟菌中公布了CRISPR系統(tǒng)，課題組在WHO-A株淋病奈瑟菌中也發(fā)現(xiàn)有CRISPR系統(tǒng)的存在。目前Pubmed及中文數(shù)據(jù)庫(kù)中均未能檢索到關(guān)于淋病奈瑟菌

3、CRISPR系統(tǒng)的報(bào)道，本文對(duì)淋病奈瑟菌CRISPR系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并克隆了部分CRISPR簇。
　　一、淋病奈瑟菌CRISPR系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析
　　檢索CRISPR數(shù)據(jù)庫(kù)(http://CRISPR.u-psud.fr/CRISPR/)發(fā)現(xiàn)，淋病奈瑟菌FA1090株、NCCP11945株和TCDC-NG08107株等的基因組中均有CRISPR簇的存在，共含12個(gè)CRISPR簇（計(jì)有15條間區(qū)序列）

4、和7個(gè)疑似CRISPR簇（計(jì)有10條間區(qū)序列），這些CRISPR簇中約1/3具有相同的重復(fù)序列，但其含有的間區(qū)序列很少同源。通過BLAST分析間區(qū)序列，可知只有少數(shù)間區(qū)序列與噬菌體同源，而更多的是與淋病奈瑟菌自身基因同源，因此我們推測(cè)CRISPR系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)移的調(diào)控具有雙向性。我們?cè)诜治鯟RISPR簇過程中發(fā)現(xiàn)了與其他細(xì)菌cas基因具有高度同源性的淋病奈瑟菌DNA序列，提示淋病奈瑟菌中也可能存在cas基因，推測(cè)其對(duì)外源基因的獲得

5、具有積極調(diào)控作用。
　　二、淋病奈瑟菌WHO-A株基因組中CRISPR的篩查
　　為分析淋病奈瑟菌其他菌株中是否也存在CRISPR系統(tǒng)，將本實(shí)驗(yàn)室保存的淋病奈瑟菌WHO-A株進(jìn)行全基因組測(cè)序和序列分析。結(jié)果表明，WHO-A株基因組大小約為2.2 Mb，與淋病奈瑟菌MS11株基因組較為相似。在WHO-A株基因組中發(fā)現(xiàn)2個(gè)疑似cas基因、1個(gè)CRISPR簇和6個(gè)疑似CRISPR簇。重復(fù)序列之間具有高度相似性，與已公布的其他淋病奈

6、瑟菌株CRISPR系統(tǒng)重復(fù)序列也高度同源。BLAST分析其間區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)也只有少數(shù)間區(qū)序列與噬菌體同源，更多的是與自身基因同源，但其噬菌體同源基因明顯多于其他3株淋病奈瑟菌，提示W(wǎng)HO-A株中水平基因轉(zhuǎn)移多于3個(gè)已公布的菌株。染色體圖譜分析發(fā)現(xiàn)，其他淋病奈瑟菌菌株中只有MS11株在對(duì)應(yīng)于WHO-A株cas基因的位置上也存在著同源cas基因，其余菌株如FA1090等的對(duì)應(yīng)位置主要為假定蛋白基因，這些基因是否編碼特殊的cas蛋白還有待于進(jìn)一

7、步研究。
　　三、淋病奈瑟菌WHO-A株CRISPR擴(kuò)增及CRISPR-靶基因間相互作用研究的預(yù)試驗(yàn)
　　對(duì)已公布的淋病奈瑟菌CRISPR序列進(jìn)行分析，據(jù)此設(shè)計(jì)4對(duì)CRISPR引物，用本實(shí)驗(yàn)室保存的5株淋病奈瑟菌為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，核酸電泳結(jié)果顯示，在淋病奈瑟菌WHO-A株中擴(kuò)增到4個(gè)不同分子量的DNA片段，提示W(wǎng)HO-A株中可能存在多種CRISPR片段。但擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后測(cè)序表明只有一對(duì)引物FA1擴(kuò)增出了有效片段，序列分析