端粒酶線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)位與人肝癌細(xì)胞多藥耐藥關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　 原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，惡性程度高、手術(shù)切除率低。因此，化療在肝癌的綜合治療中占重要的地位。但肝癌全身化療的效果較差，腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導(dǎo)致肝癌化療失敗的主要原因之一。
　　 MDR是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。MDR的發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，包括增加藥物外排、減少藥物吸

2、收、抗腫瘤藥物靶位改變、藥物活化作用減弱、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)及抗凋亡相關(guān)通路的改變等多個(gè)方面。
　　 線(xiàn)粒體一個(gè)非常重要的細(xì)胞器：為機(jī)體活動(dòng)提供能量、調(diào)控氧化還原、調(diào)節(jié)鈣離子濃度、介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞等，尤其是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和壞死，線(xiàn)粒體擔(dān)負(fù)著關(guān)鍵性作用。而細(xì)胞凋亡即是化療藥殺傷腫瘤細(xì)胞的共同通路。線(xiàn)粒體已成為篩選新型抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)之一。
　　 端粒酶是一種核糖核蛋白酶，主要由3個(gè)亞單位構(gòu)成，即端粒酶RNA(telom

3、eraseRNA，TR)、端粒酶相關(guān)蛋白質(zhì)(telomerase-associated protein，TP1/TP2)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)。研究表明，hTERT表達(dá)水平隨著端粒酶活性增加而相應(yīng)成比例增加。hTERT是人類(lèi)端粒酶活性的主要調(diào)控亞單位。
　　 端粒酶在正常人體組織表達(dá)呈陰性或陽(yáng)性率很低，而在生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和癌細(xì)胞中高表達(dá)，其主要功能是維

4、持端粒的長(zhǎng)度。端粒酶活性高表達(dá)參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程。端粒酶也可能通過(guò)拮抗細(xì)胞凋亡等作用參與腫瘤細(xì)胞MDR發(fā)生。過(guò)度表達(dá)TERT可能傳遞化療藥物抵抗信號(hào)。
　　 端粒酶主要存在于細(xì)胞核。研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶除了維持端粒長(zhǎng)度的功能外，還具有非依賴(lài)端粒的功能，如氧化應(yīng)激和藥物治療可導(dǎo)致端粒酶從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到線(xiàn)粒體并保護(hù)線(xiàn)粒體功能(保護(hù)線(xiàn)粒體DNA、降低線(xiàn)粒體ROS等)并抵抗凋亡，而不能保護(hù)細(xì)胞核內(nèi)的端粒，端粒繼續(xù)縮短。由此推斷，當(dāng)腫瘤

5、細(xì)胞接觸化療藥物時(shí)，端粒酶可能從細(xì)胞核內(nèi)移位到線(xiàn)粒體發(fā)揮線(xiàn)粒體保護(hù)作用，抵抗凋亡。因此，端粒酶線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)位可能是腫瘤細(xì)胞發(fā)生MDR的另一機(jī)制。
　　 本研究通過(guò)建立不同耐藥程度的人肝癌耐藥細(xì)胞系SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3細(xì)胞，探討端粒酶線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)位在腫瘤多藥耐藥過(guò)程中可能作用，期望為多藥耐藥逆轉(zhuǎn)提供新的干預(yù)手段。
　　 研究方法：本研究分兩部分：
　　 第一部分

6、：
　　 體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株SK-Hepl，采用大劑量沖擊，間歇誘導(dǎo)法，用順鉑誘導(dǎo)SK-Hepl細(xì)胞耐藥后，用極限稀釋法克隆篩選，建立不同耐藥程度的人肝癌耐藥細(xì)胞系SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3細(xì)胞。倒置顯微鏡比較耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)法比較耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)；CCK-8法檢測(cè)親本細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株對(duì)不同濃度的抗腫瘤藥物的藥物敏感性，計(jì)算半數(shù)抑制率(IC5

7、0)和耐藥指數(shù)(RI)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)SK-Hepl和SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2、SK-Hepl/CDDP3的細(xì)胞周期。
　　 第二部分：
　　 免疫熒光染色及Western blot作hTERT在線(xiàn)粒體和細(xì)胞核的共定位分析。
　　 適時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)線(xiàn)粒體DNA氧化損傷及細(xì)胞端粒長(zhǎng)度。
　　 采用熒光探針JC-1檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位的變化。
　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SK-

8、Hepl和SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2、SK-Hepl/CDDP3的細(xì)胞凋亡率。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.耐藥細(xì)胞SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3細(xì)胞形態(tài)基本接近親本細(xì)胞。
　　 2.與親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3生長(zhǎng)緩慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

9、
　　 3.CCK-8法測(cè)定SK-Hepl細(xì)胞IC50為5.42±0.04μg/mL，耐藥細(xì)胞SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3細(xì)胞IC50分別為40.72±0.06μg/mL、50.48±1.02μg/mL、70.61±1.06μg/mL，耐藥指數(shù)分別為7.51、9.31、13.03，耐藥細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(DOX)等抗腫瘤藥物顯示交叉耐藥(P<0.01)。

10、>　　 4.細(xì)胞周期檢測(cè)顯示，耐藥細(xì)胞G2/M和S期所占比例較親本細(xì)胞增加，G1期所占比例減少，兩組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 5.免疫熒光染色及Western blot檢測(cè)顯示：隨著耐藥指數(shù)增加，hTERT逐漸從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到線(xiàn)粒體(P<0.05)。
　　 6.適時(shí)熒光定量PCR顯示：隨著耐藥指數(shù)增加，耐藥細(xì)胞端粒長(zhǎng)度縮短；線(xiàn)粒體DNA損傷降低(P<0.01)。
　　 7.耐藥細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜

11、電位下降(P<0.05)。
　　 8.細(xì)胞凋亡率檢測(cè)顯示，耐藥細(xì)胞SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3的凋亡率較親本細(xì)胞下降(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功地建立不同耐藥程度的人肝癌多藥耐藥細(xì)胞SK-Hepl/CDDP1、SK-Hepl/CDDP2和SK-Hepl/CDDP3。
　　 2.當(dāng)腫瘤細(xì)胞接觸化療藥物后，端粒酶可能從細(xì)胞核內(nèi)移位到線(xiàn)粒