三種細胞系中DNA聚合酶β基因片段的克隆及序列分析.pdf

1、授予單位代碼!立452學號或申請?zhí)柼?4112窆密級塵玨鄭州大學碩士學位論文論文題目：三種細胞系中DNA聚合酶B基因片段的克隆及序列分析作者姓名：學科門類：專業(yè)方向：秦冰醫(yī)學腫瘤修復基因?qū)熜彰⒙毞Q：章茜教授趙國強副教授二零零五年五月十三日鄭州大學碩士研究生畢業(yè)論文三種細胞系中DNA聚合酶B基因片段的克隆及序列分析細胞系是目前研究p01B功能應用較多的宿主，是野生型和突變型p01D轉(zhuǎn)染的對象，了解它們自身p018的情況將有助于弄清食管

2、癌細胞的形態(tài)、生物學、免疫和細胞遺傳等方面的性狀，并且可以提供抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的新思路。本實驗旨在對己建立的三種細胞系中DNA聚合酶B的eDNA全基因克隆及序列分析，為進一步研究pol8基因和食管癌之間的關系提供一個更可靠的依據(jù)和研究背景。方法從Ecal09、Eca9706和NIH3T3三種細胞系中提取總RNA，通過RT—PCR擴增出polt3cDNA全基因編碼序列；將其連接在pGEM—TEasy質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化入JMl09，利用A111p抗

3、性和藍白篩選實驗篩選轉(zhuǎn)化人細菌的陽性菌落，運用pGEM—TEasy載體克隆鑒定引物T7／SP6對連接的正確性進行鑒定，從而確定陽性克隆。且進行DNA測序，與GenBank中對應的標準序列進行比較。結(jié)果L靶基因擴增及酶切鑒定：通過RT—PCR擴增出三個細胞系的polB全長aDNA片段，經(jīng)EcoRI酶切鑒定正確。2克隆結(jié)果鑒定：將靶基因與pG叫一TEasy質(zhì)粒連接后，轉(zhuǎn)化入JI^109，藍白篩選后隨機選擇6個陽性菌落以T7／SP6作為引物進

4、行PCR擴增，得到長度均為約11kb的陽性克隆。3利用生物學軟件對重組質(zhì)粒中三種細胞系的目的基因與GenBank公布的polB基因序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)：(i)Ecal09中有3個核苷酸突變，325位A—G，721位A—G，1071位T—C，基因序列同源性為997％：②Eca9706中有4個核苷酸突變，721位A—G，768位c—T，80l位A—G，853位A—G，基因序列同源性為996％：@N1H3T3無突變發(fā)生。結(jié)論本實驗成功地對