利用微小基因組建立評(píng)價(jià)HCV NS5B聚合酶活性的細(xì)胞系統(tǒng).pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)屬于黃病毒科(Flaviviridae),肝炎病毒屬(Hepacivirus),是引起慢性肝病的主要病原體之一。HCV感染呈全球流行狀態(tài),是導(dǎo)致肝硬化和肝癌的最主要病因,約有1.3億HCV感染者。HCV為單正鏈RNA病毒,基因組全長(zhǎng)約為9.6 kb,兩端含有5′非編碼區(qū)(5′UTR)和3′非編碼區(qū)(3′UTR),中間為一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。開(kāi)放閱讀框可編碼一個(gè)多聚蛋白前體,然

2、后在宿主與病毒蛋白酶的共同作用下加工成為3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白分別為核心蛋白(Core)、包膜糖蛋白E1和E2,非結(jié)構(gòu)蛋白分別為p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中,非結(jié)構(gòu)蛋白NS5B具有RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)活性,是HCV RNA合成和復(fù)制的關(guān)鍵酶,是抗 HCV治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。隨著對(duì)病毒基因組復(fù)制機(jī)制的深入理解,利用R

3、NA病毒的反向遺傳技術(shù)建立的微小基因組系統(tǒng)為研究 HCV的復(fù)制、與宿主細(xì)胞之間的相互作用、致病機(jī)制以及抑制劑的篩選提供了新的工具,進(jìn)一步為建立HCV NS5B抑制劑的高通量篩選體系提供了技術(shù)支撐。因此,本研究利用HCV NS5B的RdRp活性和反向遺傳技術(shù),建立可評(píng)價(jià)HCV NS5B聚合酶活性的新型細(xì)胞系統(tǒng),為HCV NS5B抑制劑的高通量篩選提供新的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。
　　基于目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于HCV復(fù)制機(jī)理的最新進(jìn)展,并且以本室前期的

4、研究為基礎(chǔ),首先分別設(shè)計(jì)并且構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP、微小基因組(-)5UIRrG(-)3U和真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U。然后通過(guò)將pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pCMV/5UrFI3Urz質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞中螢火蟲(chóng)熒光素酶(FLuc)活性,對(duì)pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP中NS5B活性進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)將pcDNA3.

5、1(+)-(-)5UIRrG(-)3U和pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞中的Gaussia熒光素酶(GLuc)活性,對(duì)微小基因組(-)5UIRrG(-)3U的功能進(jìn)行了鑒定。主要研究結(jié)果如下:
　　1.成功構(gòu)建了表達(dá)HCV NS3-5B復(fù)制復(fù)合體的質(zhì)粒并鑒定了NS5B聚合酶的活性
　　(1)通過(guò)PCR方法擴(kuò)增HCV NS3-5B全長(zhǎng)基因片段,然后成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)

6、粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP。酶切鑒定以及測(cè)序比對(duì)正確后,轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞,熒光成像可以觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá),Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示NS3-4A蛋白和NS5B蛋白均在細(xì)胞中得到表達(dá)。
　　(2)重組質(zhì)粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pCMV/5UrFI3Urz(本室前期構(gòu)建)共轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中,結(jié)果顯示所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP中的N

7、S5B具有RdRp活性,并且NS3-5B復(fù)制復(fù)合體中的NS5B活性明顯高于單獨(dú)的NS5B活性。
　　2.成功構(gòu)建了(-)5UIRrG(-)3U微小基因組并鑒定了其功能
　　(1)設(shè)計(jì)了一段兩端含有HCV負(fù)鏈5′UTR和負(fù)鏈3′UTR序列,中間含有EMCV IRES-DsRed2正向序列和GLuc編碼基因的反向互補(bǔ)序列(rvGLuc)的微小基因組片段(-)5UIRrG(-)3U。分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增各基因片段的上下游引物,然后利用重疊

8、延伸PCR技術(shù)將擴(kuò)增出的各基因片段成功拼接。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示各基因片段大小正確。
　　(2)成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U。酶切鑒定以及測(cè)序比對(duì)正確后,轉(zhuǎn)染至 BHK-21細(xì)胞后,紅色熒光蛋白得到表達(dá),細(xì)胞內(nèi)重組質(zhì)粒中的微小基因組具有正常的功能。
　　3.初步建立了評(píng)價(jià)HCV NS5B聚合酶活性的細(xì)胞系統(tǒng)
　　在pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pcDNA3.

9、1(+)-(-)5UIRrG(-)3U重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞中,熒光成像可以觀察到綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白同時(shí)得到表達(dá),并且位于復(fù)制復(fù)合體中的NS5B蛋白可以使微小基因組片段進(jìn)行正常的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,GLuc得到表達(dá)并且分泌至細(xì)胞培養(yǎng)液中,進(jìn)而可以通過(guò)檢測(cè) GLuc的活性來(lái)評(píng)價(jià)NS5B聚合酶的活性。
　　綜上所述,本研究成功構(gòu)建了HCV NS3-5B的真核表達(dá)載體和含有報(bào)告基因的微小基因組載體,將兩者組合初步建立了評(píng)價(jià)HC