一種直觀在體反映HCV RdRp酶活性的新型轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立.pdf

1、【背景】
　　丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）屬于黃病毒科（Flaviviridae）肝炎病毒屬（Hepacivirus），是引起人類慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌的重要病原體之一。HCV感染呈全球化流行，目前約有1.7億感染者，尚無有效的預(yù)防疫苗。HCV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約9.6Kb，由一個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)、5′非編碼區(qū)（untranslated re

2、gion，UTR）和3′UTR構(gòu)成，5′UTR和3′UTR是RNA復(fù)制與翻譯過程中重要的調(diào)控元件。ORF編碼一個(gè)約由3000個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白前體，多聚蛋白前體在宿主信號(hào)肽酶和病毒蛋白酶共同作用下被加工為10個(gè)成熟的病毒蛋白，包括3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（核心蛋白、包膜糖蛋白E1和E2）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。研究證實(shí)，NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B主要參與病毒RNA的復(fù)

3、制，其中NS5B具有RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）活性，在RNA復(fù)制過程中發(fā)揮最關(guān)鍵的作用，被認(rèn)為是抗HCV治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
　　目前，針對(duì)NS5B靶點(diǎn)的藥物Sofosbuvir已被批準(zhǔn)上市，臨床療效顯著，證實(shí)了NS5B是抗 HCV治療的理想靶點(diǎn)，但該藥價(jià)格極其昂貴，難以被推廣應(yīng)用。NS5B抑制劑研發(fā)進(jìn)展緩慢，主要原因是由于缺乏抑制劑評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。隨著對(duì) HCV R

4、NA復(fù)制機(jī)制的深入研究，利用RNA病毒的反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了兩端含有HCV5′UTR和3′UTR、中間為報(bào)告基因序列的HCV微小基因組系統(tǒng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了該系統(tǒng)可以模擬HCV RNA的復(fù)制，為RdRp酶活性評(píng)價(jià)提供了有效的工具。然而體外實(shí)驗(yàn)缺乏細(xì)胞之間的相互作用，不能真實(shí)的反映 HCV感染時(shí)機(jī)體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下RdRp酶的活性。與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相比，在體研究能夠更加真實(shí)的模擬人體內(nèi)環(huán)境。因此，建立一種能夠反映HCV RdRp酶活性的動(dòng)物模型，可以

5、為HCV抑制劑的研發(fā)提供更加有效的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)平臺(tái)。
　　【目的】
　　利用眼底靜脈叢水動(dòng)力基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立一種直觀在體反映HCV RdRp酶活性的新型轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型。
　　【方法】
　　質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B經(jīng)酶切線性化，通過受精卵顯微注射技術(shù)制備HCV NS3-5B轉(zhuǎn)基因首建鼠，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因首建鼠。轉(zhuǎn)基因首建鼠與 C57BL/6小鼠雜交，經(jīng)PCR、RT-PCR和Western blot鑒

6、定子代小鼠，子代陽性小鼠繼續(xù)與C57BL/6小鼠雜交，直到篩選出遺傳性狀穩(wěn)定的HCV NS3-5B轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　眼球采血分離血清，測(cè)定血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST，以C57BL/6小鼠血清測(cè)定指標(biāo)作為對(duì)照，分析HCV NS3-5B轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST是否發(fā)生明顯變化；通過肝、腎、脾組織HE染色分析NS3-5B轉(zhuǎn)基因小鼠組織形態(tài)改變。
　　根據(jù)HCV微小基因組和HDV核酸酶基因序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增含有HDV核酸酶序

7、列的A片段和B片段的引物，以質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-(-)3UIRrG(-)5為模板，利用重疊延伸PCR分別擴(kuò)增A和B片段，酶切克隆到載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-MCS，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-H0299G，經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序鑒定。
　　利用眼底靜脈叢水動(dòng)力基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將pcDNA3.1(+)-H0299G轉(zhuǎn)染NS3-5B轉(zhuǎn)基因小鼠，通過 Western blot、單個(gè)組織器官活體成像和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)

8、GLuc在小鼠組織中的表達(dá)；通過血清ALT和AST檢測(cè)以及肝組織HE染色評(píng)估小鼠肝組織的損傷。此外，利用化學(xué)發(fā)光原理對(duì)小鼠血漿中GLuc的表達(dá)量和在體發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。
　　【結(jié)果】
　　質(zhì)粒pIRES2-EGFP-NS3-5B酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離鑒定，獲得了預(yù)期大小的NS3-5B轉(zhuǎn)基因載體片段；NS3-5B轉(zhuǎn)基因首建鼠經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定，獲得了預(yù)期大小的目的基因條帶。
　　NS3-5B轉(zhuǎn)基因首建鼠與C57BL/6小鼠雜交

9、，子代小鼠經(jīng)PCR、RT-PCR、Western blot鑒定獲得預(yù)期大小的目的條帶，經(jīng)連續(xù)雜交鑒定篩選出遺傳性狀穩(wěn)定的NS3-5B轉(zhuǎn)基因小鼠。與C57BL/6小鼠相比，NS3-5B轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT、AST以及組織HE染色均未發(fā)現(xiàn)有明顯病理形態(tài)改變。
　　Western blot、組織器官活體成像和免疫組織化學(xué)染色證實(shí)眼底靜脈叢水動(dòng)力基因轉(zhuǎn)染技術(shù)具有肝組織特異性轉(zhuǎn)染效果，經(jīng)血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST檢測(cè)以及肝組織HE染色顯示該技

10、術(shù)只對(duì)小鼠肝組織造成短暫性的物理損傷，但這種損傷機(jī)體可以自行修復(fù)，不會(huì)對(duì)其正常生理功能造成影響。
　　質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-H0299G在體轉(zhuǎn)染后，與C57BL/6小鼠相比，NS3-5B轉(zhuǎn)基因小鼠血清GLuc實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)以及動(dòng)態(tài)活體熒光成像均發(fā)現(xiàn)GLuc表達(dá)顯著，表明HCV微小基因組在NS3-5B轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)可以復(fù)制并表達(dá)GLuc。
　　【結(jié)論】
　　本研究成功構(gòu)建了表達(dá)HCV復(fù)制復(fù)合體的NS3-5B轉(zhuǎn)基因小鼠模型