一種新型miRNA功能測(cè)定系統(tǒng)的建立.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類19-25bp內(nèi)源非編碼小RNA，在真核生物中普遍存在。多數(shù)miRNA采用Ⅱ型啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在加工成熟過(guò)程中依次經(jīng)歷了三種主要形式：初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物primarymiRNA(pri-miRNA)，發(fā)卡狀前體(precursormiRNA，pre-miRNA)，和成熟體miRNA(maturemiRNA)。目前有關(guān)miRNA功能的研究主要證實(shí)其成熟體對(duì)靶標(biāo)基因的表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。 常用的m

2、iRNA的研究方法主要是功能缺失或獲得實(shí)驗(yàn)。測(cè)定待研究的miRNA的效應(yīng)可以在表達(dá)該miRNA的細(xì)胞系或不表達(dá)該miRNA的細(xì)胞系中分別進(jìn)行。對(duì)于前者可以通過(guò)使用甲基修飾的反義寡核苷酸敲除該miRNA，抑制它的功能活性。對(duì)于后者則可以通過(guò)轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miRNA或轉(zhuǎn)染miRNA表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)該miRNA功能的增強(qiáng)或獲得。直接轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miRNA對(duì)進(jìn)行一般的研究工作固然方便快捷，但費(fèi)用高、轉(zhuǎn)染效果維持短暫，這對(duì)滿足長(zhǎng)周期體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的

3、要求，適應(yīng)未來(lái)應(yīng)用于臨床治療等方面都不如miRNA表達(dá)載體。 目前文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)使用過(guò)的miRNA表達(dá)載體，按照載體直接轉(zhuǎn)錄出的miRNA的形式劃分，大致有以下三類，即primarymiRNA載體，precursormiRNA載體，和maturemiRNA載體，這些載體各自的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物依次進(jìn)入內(nèi)源miRNA加工成熟過(guò)程的不同階段，利用內(nèi)源miRNA加工成熟通路及內(nèi)源miRNA行施功能的機(jī)制，來(lái)實(shí)現(xiàn)外源miRNA的表達(dá)與功能。對(duì)這三類載

4、體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生外源miRNA的效率，對(duì)內(nèi)源miRNA的產(chǎn)生及功能的影響，對(duì)外源miRNA是否能完全模擬內(nèi)源miRNA而被整合進(jìn)入miRISC等各方面的集中比較分析鮮見(jiàn)報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)起初為了能夠找到miRNA的最佳表達(dá)載體以及構(gòu)建特定miRNA靶標(biāo)基因檢測(cè)系統(tǒng)，依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)結(jié)合shRNA的設(shè)計(jì)原理，以人類miRNAlet-7a為代表，依次構(gòu)建出pri-miRNA載體，模仿shRNA的pre-miRNA載體，和maturemiRNA

5、載體，以及含有l(wèi)et-7a靶點(diǎn)的熒光效應(yīng)元件，希望通過(guò)分析比較三種形式的miRNA表達(dá)載體對(duì)含let-7a靶標(biāo)HMGA23’末端非翻譯區(qū)(HMGA23’UTR)的熒光效應(yīng)元件的抑制效果及程度，來(lái)初步尋找最佳的miRNA表達(dá)載體以及構(gòu)建let-7a靶標(biāo)基因3’UTR的檢測(cè)系統(tǒng)。但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)沒(méi)有合適的細(xì)胞系能夠作為工具性細(xì)胞系，即不對(duì)含HMGA23’UTR的熒光效應(yīng)元件產(chǎn)生內(nèi)源性干擾。為了解決這一矛盾，找到miRNA熒光效應(yīng)元件不受細(xì)

6、胞系內(nèi)源性miRNA表達(dá)譜影響的方法，突破細(xì)胞系的種類對(duì)檢測(cè)特定miRNA的限制，產(chǎn)生具有普遍適用性的細(xì)胞系，我們采用RNAi的方法，直接敲除內(nèi)源miRNA加工成熟通路上的關(guān)鍵蛋白(但避開(kāi)外源miRNA加工成熟所需的蛋白)，或直接特異性敲除內(nèi)源let-7a，嘗試構(gòu)建減少細(xì)胞內(nèi)源miRNA背景對(duì)熒光效應(yīng)元件影響的一種新型的miRNA功能測(cè)定系統(tǒng)，以期在這樣一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)對(duì)不同形式的miRNAlet-7a表達(dá)載體表達(dá)外源let-7a的效率進(jìn)

7、行評(píng)價(jià)。 在Hela細(xì)胞系內(nèi)我們初步完成了對(duì)這一工作的前期準(zhǔn)備和探討研究。通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法證實(shí)了在Hela細(xì)胞系中我們自行設(shè)計(jì)的用于RNAi敲除實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)載體質(zhì)粒pcDNA3-H1和shRNA表達(dá)框架是成功的，可以用于進(jìn)行干擾內(nèi)源蛋白或干擾內(nèi)源miRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)RNAi實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)pcDNA3-H1-sh-A-R-let-7a對(duì)含有HMGA23’UTR的熒光效應(yīng)元件恢復(fù)熒光的效果最好。但是熒光恢復(fù)的程度相對(duì)比較微弱，這對(duì)我們