一種新型轉錄因子MrkH的結構與功能研究.pdf

1、肺炎克雷伯氏菌是一種常見的醫(yī)院感染條件致病菌，它可以在醫(yī)用器材表面形成生物膜來抵抗多種抗生素。生物膜的形成受多種因素的調節(jié)，在微生物細胞從浮游狀態(tài)轉變?yōu)樯锬顟B(tài)時一個非常重要的指標就是胞內重要的第二信使分子3′，5′-環(huán)二鳥嘌呤核苷酸（c-di-GMP）水平的升高。甘露糖抗性的克雷伯氏菌狀(Mrk)血凝素或“Mrk蛋白”是肺炎克雷伯氏菌形成生物膜的關鍵因子。它是由mrkABCDF操縱子來編碼的，這些基因編碼組成克雷伯氏菌的三型菌毛-該

2、型菌毛在克雷伯氏菌生物膜形成過程中起著重要作用。菌毛還可以幫助細菌病原體附著在宿主細胞上來完成感染，已知的克雷伯氏菌中含有一型和三型兩種菌毛。MrkA是主要的菌毛菌絲亞單位，它們不斷堆積構成了螺旋菌毛軸，MrkB和MrkC作為周質空間分子伴侶分別將MrkA和MrkD轉運至外部菌毛的菌絲處，MrkD形成菌絲的粘附末端。三型菌毛還可以調節(jié)菌體附著胞外基質蛋白，例如5型膠原以及肺上皮細胞基底膜區(qū)域。
　　近來的研究表明mrk基因簇編碼的

3、三型菌毛的表達是受一種c-di-GMP水平依賴的轉錄因子-MrkH調控的。MrkH作為一種新穎的轉錄調節(jié)因子，c-di-GMP可以直接調控它的轉錄活性進而影響生物膜形成的相關基因的表達。MrkH有兩個結構域組成:一個N端的YcgR-N類似結構域和一個C端的PilZ結構域。PilZ結構域是一個經典的c-di-GMP結合結構域，而YcgR-N結構域的功能依舊不清楚。據(jù)我們所知，MrkH是第一個被發(fā)現(xiàn)包含PilZ結構域的DNA結合蛋白。但是關

4、于它如何識別DNA序列的依舊有很多爭議。2011年Wilksch等人首先發(fā)現(xiàn)MrkH是一個c-di-GMP依賴的轉錄調節(jié)因子，并通過后續(xù)的研究定位了MrkH結合mrkA以及自身mrkHI轉錄調控區(qū)域的DNA結合序列。但最近StevenC legg課題組研究發(fā)現(xiàn)MrkH和MrkI一起可以更高效地調控三型菌毛的表達。MrkI是一個經典的DNA結合蛋白，并且mrkI基因緊接著mrkH,并且mrkHI共轉錄。所以它是否直接參與MrkH的轉錄調控

5、還不是很清楚。本文我們想通過獲得MrkH，MrkH/c-di-GMP以及MrkH和DNA復合物的晶體結構來研究MrkH結合DNA的方式，同時我們還綜合運用生物化學、分子生物學及微生物學的多種實驗方法結合來揭示MrkH單獨或者與MrkI一起結合DNA并調控三型菌毛表達這一過程的分子機制。
　　本論文的主要研究內容和結論如下:
　　(1)利用蛋白質晶體X射線衍射法解析得到了2.3(A)分辨率的克雷伯氏菌轉錄因子MrkH蛋白結合c

6、-di-GMP的復合物結構。將MrkH/c-di-GMP結構與其他PilZ蛋白結構進行對比發(fā)現(xiàn)它們在折疊類型上很相似，但是結構細節(jié)有較大的差別，尤其是在PilZ結構域。MrkH蛋白主要以單體形式存在，并且它的PilZ域有許多堿性蛋白富集區(qū)，很可能會結合一些負電荷分子，比如DNA分子。
　　(2)通過MrkH/c-di-GMP復合物結構的仔細分析，發(fā)現(xiàn)了c-di-GMP小分子與MrkH蛋白之間的結合方式。并利用等溫滴定量熱法驗證了M

7、rkH的保守氨基酸對c-di-GMP結合的具體貢獻。
　　(3)利用體外凝膠電泳遷移實驗分析并定位了MrkH蛋白結合DNA的主要結構域，發(fā)現(xiàn)MrkH的PilZ結構域可以獨自結合DNA分子，并且具有獨特地結合DNA的方式:一條長鏈DNA分子可以不斷地結合PilZ蛋白分子。由此推斷MrkH蛋白結合DNA可能是非特異性的。在加入特異性的MrkH DNA盒子后，我們又獲得了一種MrkH/c-di-GMP復合物，我們通過結合之前獲得的結構進

8、行比較發(fā)現(xiàn)MrkH在DNA存在下結合c-di-GMP后，其c-di-GMP結合的loop會更加彎曲，使得其YcgR-N和PilZ結構域相對位置更加靠近。
　　(4)通過對MrkH的結構分析，找到了位于蛋白質表面可能與DNA結合有關的正電荷密集的區(qū)域。并通過定點突變的方法，克隆并純化得到了多種MrkH的突變體。EMSA實驗證明突變體蛋白都喪失或減弱了DNA結合的活性。同時利用熒光偏振的方法計算了各種MrkH突變體結合DNA的結合常數(shù)

9、，進一步驗證了MrkH主要通過其表面的正電荷區(qū)域結合非特異性的DNA序列，這些與DNA結合相關的關鍵氨基酸大部分位于其PilZ結構域。我們還嘗試利用最新的冷凍電鏡技術來解析MrkH與DNA的結構，經過許多努力，我們沒能獲得質量很好的單顆粒，這也驗證了MrkH結合DNA的復雜性。
　　(5)MrkH和一個包含HTH結構域的DNA結合蛋白MrkI一起共轉錄，我們猜想MrkH會和MrkI一起調控克雷伯氏菌的菌毛表達。因為MrkI蛋白的表

10、達一直不成功，我們通過MBP融合蛋白來獲得MrkI，經過體外pull down實驗，我們驗證了MrkI可以和MrkH形成復合物，并且MrkH主要通過它的N端結構域和MrkI結合。MrkI也可以結合mrkABCDF基因簇和它自己的啟動子調控序列，這表明MrkI可能發(fā)揮特異性的DNA識別功能。
　　根據(jù)以上實驗結果，我們提出了MrkHI自我調控和調控細菌三型菌毛合成分子機制:一種可能是MrkHI形成復合體后一起識別結合MrkHI和mr

11、k基因簇的轉錄調控區(qū)域，MrkI主要發(fā)揮特異性識別DNA的功能，這期間MrkH可能會輔助MrkI結合DNA并且c-di-GMP結合MrkH造成了MrkH兩端結構域的相對位置改變，造成了MrkHI結合DNA的構象改變，使得轉錄調控更加高效。也有可能還存在著另一種未知蛋白X，它會和MrkHI形成三元復合物，并主要由X來特異性識別DNA。而c-di-GMP也主要是通過對MrkH的構象調整進而影響三元復合物結合DNA的能力。
　　MrkH

12、的PilZ結構域只有120多個氨基酸，但它不但可以結合c-di-GMP小分子，同時具有結合DNA的能力。這表明PilZ結構域還有許多我們未發(fā)現(xiàn)的功能。MrkI是一個典型的LuxR-型轉錄因子，具有螺旋-轉角-螺旋DNA結合結構域，但它的表達一直不夠完善。我們首次發(fā)現(xiàn)PilZ結構域也是一種新的DNA結合結構域。但是它結合DNA的模型還不夠清楚，我們可以確定PilZ域在體外結合非特異性的DNA，但體內c-di-GMP的濃度變化是否影響其DN