豬腮腺分泌蛋白基因的克隆及消除磷污染植酸酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立.pdf

1、單胃動物的高磷糞便是農(nóng)業(yè)磷污染的主要來源.人們曾經(jīng)嘗試向飼料添加植酸酶來解決這一問題,但由于飼料加工過程會帶來植酸酶活性的喪失,使得這一方法難以得到令人滿意的效果,因此探索更為有效的途徑已成為目前研究的一個重要課題.通過豬和禽類內(nèi)源性消化道生產(chǎn)植酸酶成為解決單胃動物高磷糞便污染的一種新的研究策略和手段.在這一領(lǐng)域的研究中前人已經(jīng)取得了令人振奮的成果,利用小鼠腮腺分泌蛋白基因調(diào)控區(qū)已獲得在唾液中表達植酸酶的轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因豬.如果利用豬

2、內(nèi)源性的腮腺分泌蛋白基因來生產(chǎn)植酸酶轉(zhuǎn)基因豬將有著不可比擬的優(yōu)勢,因此該實驗擬首次采用豬內(nèi)源性腮腺分泌蛋白的啟動子成分與大腸桿菌(E.coli)植酸酶基因構(gòu)建在唾液腺中特異高效表達的重組體,利用豬內(nèi)源產(chǎn)生的大量植酸酶消化分解飼料中的植酸來達到解決豬排泄物中磷對環(huán)境污染的難題.腮腺分泌蛋白PSP(parotid secretory protein)是唾液中組織特異性高表達的一種蛋白,其體外功能研究表明與抗菌作用有關(guān).利用小鼠PSP基因調(diào)控

3、區(qū)構(gòu)建的高效表達載體,證明了唾液腺作為生物反應(yīng)器的巨大潛力.然后目前缺乏豬PSP基因的相關(guān)信息,因此該研究根據(jù)人、牛和鼠PSP基因的cDNA序列設(shè)計兼并引物,通過3'和5'RACE獲得豬PSP基因全長cDNA序列.然后依據(jù)所得到的豬PSP基因cDNA序列設(shè)計引物篩選豬的BAC基因組文庫,獲得攜帶有完整豬PSP基因的BAC克隆,通過序列測定得到豬cDNA基因組基因的序列信息,并利用該基因的上、下游調(diào)控區(qū)成分開展腮腺特異性表達植酸酶基因的轉(zhuǎn)

4、基因小鼠模型的研究.該研究中所獲得的豬PSP基因cDNA含有一個完整的開放閱讀框,編碼238個氨基酸(GenBank注冊號為AY205234).用BLAST和ClustalW軟件進行同源性分析,結(jié)果表明豬PSP基因與人和牛PSP基因是高度同源的.推導(dǎo)出的氨基酸序列與人、牛和小鼠及大鼠的同源性分別為53％、43％和32％、32％.在蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)上,豬PSP與人PSP基因也是非常地相像.通過RT-PCR、點雜交和Northern雜交

5、證明豬PSP基因是組織特異性表達.通過BAC文庫篩選,獲得含豬PSP基因的陽性克隆,測得豬PSP基因的8個外顯子和7個內(nèi)含子及PSP基因10kb上游調(diào)控區(qū).經(jīng)過測序得到約22kb的豬PSP基因的基因組序列(GenBank注冊號為AY197556).利用RH輻射雜種板定位方法將豬PSP基因定位在豬17號染色體長臂q21-23區(qū)域.利用豬PSP基因的上游調(diào)控區(qū)、信號肽、大腸桿菌植酸酶基因和牛生長激素基因下游調(diào)控區(qū)或豬PSP基因的下游調(diào)控區(qū)構(gòu)

6、建了兩個植酸酶轉(zhuǎn)基因表達載體.通過顯微注射注獲得了植酸酶轉(zhuǎn)基因小鼠,篩選出6只陽性小鼠,進行唾液中植酸酶活性檢測、糞便植酸磷的檢測.糞便中植酸磷檢測結(jié)果表明:40號和68號陽性鼠糞便中植酸磷含量顯著降低,正在進行重復(fù)驗證.第二個植酸酶表達載體獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠正在檢測中.植酸酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型成功的建立為植酸酶環(huán)保豬的產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ).另外,為進一步對豬PSP基因的調(diào)控區(qū)進行功能分析,又利用綠色熒光蛋白基因EGFP和豬PSP基因的上游調(diào)控區(qū)和