轉(zhuǎn)基因小鼠平臺的建立、技術(shù)優(yōu)化及Tie2-CreERTM轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建.pdf

1、轉(zhuǎn)基因小鼠是最早建立的轉(zhuǎn)基因動物。此項技術(shù)是近年來生命科學中最熱門，發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學家不可缺少的研究工具。它可以通過對基因的操作，直接觀察基因在活體內(nèi)的活動情況及其表達產(chǎn)物所引起的表型效應。其已廣泛應用于分子生物學、免疫學、發(fā)育生物學、制藥及畜牧育種等各個研究領(lǐng)域中，既具有深遠的理論價值，又有重大的應用價值。
　　成功高效的基因轉(zhuǎn)移是轉(zhuǎn)基因動物制備的關(guān)鍵，依據(jù)基因轉(zhuǎn)移方式的不同目前制作轉(zhuǎn)基因小鼠的方法有十多種

2、之多。受精卵原核顯微注射法是當前最常用最有效的建立轉(zhuǎn)基因動物的方法之一。其基本過程是利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)，用直徑約為1μm的玻璃管直接插入受精卵的雄原核內(nèi)，將毛細管內(nèi)所帶有的外源基因的DNA注入受精卵原核，使外源基因整合到動物基因組，再通過胚胎移植技術(shù)將整合有外源基因的受精卵移植到受體的輸卵管或子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，產(chǎn)下的攜帶有外源基因的子代即得到轉(zhuǎn)基因動物。受精卵原核顯微注射法是目前基因轉(zhuǎn)移效率較好的一種基因轉(zhuǎn)移方法，為了實現(xiàn)對多

3、種基因的快速準確的分析，我們精心建立了小鼠受精卵原核顯微注射系統(tǒng)。包括顯微注射室的改造，儀器的購置與安裝，不孕雄鼠的結(jié)扎，供體小鼠的超排卵，假孕雌鼠的制作，原核注射及胚胎輸卵管移植等各個環(huán)節(jié)。成功建立了制作轉(zhuǎn)基因小鼠的受精卵原核顯微注射系統(tǒng)平臺。
　　受精卵原核注射法是一項技術(shù)性很強的工作，操作精細，涉及的步驟繁雜，影響因素多，稍有不慎便得不到預期的結(jié)果。我們又在如何提高實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和整合效率方面，進行了一些有益的探索和技術(shù)優(yōu)

4、化。建立了提高實驗結(jié)果及穩(wěn)定性的優(yōu)化方案。
　　實驗證明用3～5周齡，體重12～14g的CBAXC57BL/6的雜交一代F1雌鼠，第1天13:30腹腔注射5IUPMSG，第3天12:30注射5IUhCG后立即與雄種鼠合籠，第4天10:30取卵，能得到最好的超排數(shù)量及質(zhì)量的受精卵細胞。雄原核注射時每個卵細胞注射1～2μg/ml（2～4pl）的線性化的純化的DNA溶液，受精卵成活，發(fā)育成2細胞率最高。胚胎移植時每只受體雌鼠每側(cè)移植10

5、～15枚，產(chǎn)仔率最佳。KM是經(jīng)濟又好用的受體鼠種。我們建立了提高實驗結(jié)果及穩(wěn)定性的優(yōu)化方案。
　　基于此項技術(shù)我們構(gòu)建了在內(nèi)皮細胞特異性表達可誘導Tie2-CreERTM轉(zhuǎn)基因小鼠。首先我們構(gòu)建了在內(nèi)皮細胞中特異性表達Cre重組酶的可誘導的轉(zhuǎn)基因表達載體Tie2-CreERTM-coreenhancer和Tie2-CreERTM-fullenhancer，通過顯微注射方法，注射入C57BL/6與CBA的雜交F1代小鼠受精卵原核中，

6、移植到受體小鼠的輸卵管傘部，生下的仔鼠用PCR的方法擴增基因組DNA，共篩選出3系Tie2-CreERTMcoreenhancer和1系Tie2-CreERTM-fullenhancer轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　此轉(zhuǎn)基因小鼠可作為血管內(nèi)皮細胞譜系分析和在血管內(nèi)皮細胞進行條件基因打靶的理想工具小鼠。如用此轉(zhuǎn)基因小鼠與我室擁有的轉(zhuǎn)基因RBP-Jfloxed小鼠交配后，仔鼠注射它莫西酚即可誘導在血管內(nèi)皮細胞條件性剔除RBP-J基因。通過組織學及