睪丸內注射法建立轉基因小鼠的實驗研究.pdf

1、轉基因動物是指通過人工的方法將外源基因導入動物染色體基因組，使之穩(wěn)定表達并能遺傳給后代的一類動物。隨著技術的進步，轉基因動物在醫(yī)學、生命科學、生物制藥等領域都有著廣泛的研究和應用前景，因此科學家們一直在探索一種更簡便易行、經濟實用而又高效的轉基因方法。近年來，體內基因轉移己成為用于基因治療、生物學分析等領域非常受歡迎的一種技術。脂質體是一種新型的轉染介質，可以通過細胞的內吞或吞噬作用，將所攜帶的目標基因導入細胞中。因其對細胞毒性低，對轉

2、染的核酸類型和分子量有很高的包容性；且易于制備、免疫原性低、轉染操作簡單，故應用范圍越來越廣泛，不僅用于瞬時轉染，也可用于永久表達系的建立。 精原干細胞(spermatogonialstemcells，SSCs)是位于睪丸曲細精管基膜上既能自增殖維持自身群體恒定，又能定向分化產生分化型精原細胞的雄性生殖系干細胞，其白增殖過程幾乎可以貫穿機體的整個生命而又兼有向子代傳遞遺傳信息的能力。為了探討在體睪丸曲精細管內注射法制備轉基因動物

3、的可行性。首先摸索了小鼠精原干細胞體外培養(yǎng)細胞形態(tài)及培養(yǎng)條件。轉染液采用脂質體包裹綠色熒光蛋白報告基因pIRES-EGFP質粒。為篩選最佳轉染效果，采用不同配比的plRES-EGFP質粒與脂質體組成轉染試劑，分別在轉染后不同時間點熒光顯微鏡下觀察細胞活力與轉染率。結果顯示與支持細胞共培養(yǎng)能促進SSCs的存活和增殖，通過飼養(yǎng)層細胞輔助培養(yǎng)是體外培養(yǎng)SSCs較好的手段。脂質體Lipofectamine2000濃度高，對細胞有毒性作用，濃度低

4、，轉染效率低。通過細胞活力計數，篩選出轉染液中DNA與脂質體Lipofectamine2000的最佳配比為2μg:5μl。在轉染后36h，細胞轉染率最高，達到31.5％。 在細胞實驗的基礎上，對小鼠進行睪丸內注射。A組小鼠進行外科手術，在體視顯微鏡下對小鼠曲精細管進行注射，轉染液混有1％臺盼藍，起指示作用。每個睪丸選2～3個注射點，使睪丸表面約30％以上的曲細精管變藍，考慮到小鼠睪丸的容積，每只小鼠的注射量為40μl。B組小鼠不

5、進行外科手術，采用多點多次注射方式，直接進行睪丸注射，每三天注射一次，共進行三次注射，每只小鼠每次注射量為4μl。PCR結果顯示A組F1代轉基因陽性率31.4％，F2代轉基因陽性率11.7％，B組F1代轉基因陽性率17.1％，F2代轉基因陽性率12.5％。證實曲精細管注射法可成功制備轉基因動物，轉基因效率較高。無須外科手術，通過直接睪丸多點多次反復注射，證實可成功制備含有外源基因的轉基因后代，這為大型家畜的轉基因技術開辟了一條新途徑。