單精子注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家兔胚胎的研究.pdf

1、該文系統(tǒng)的研究了用單精注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家兔胚胎過程中,不同處理的精子對外源基因的結(jié)合能力,影響精子結(jié)合外源DNA的因素以及促進精子結(jié)合外源基因的方法.以GFP基因作為轉(zhuǎn)基因家兔胚胎的報告基因,生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家兔胚胎.經(jīng)過洗滌的兔精子具有明顯吸附6-甲基諾丹明-6-dUTP標(biāo)記的DNA的能力,而且洗滌的程度越好轉(zhuǎn)染率越高,但精液的活力隨洗滌程度下降而下降,從而影響轉(zhuǎn)染率.經(jīng)液氮凍過的兔精子能吸附6-甲基諾丹明-6-dUTP標(biāo)記的DNA,而且具

2、有穩(wěn)定性.經(jīng)液氮凍過的精子與標(biāo)記的DNA除了結(jié)合在精子頭后部核區(qū)外,也能結(jié)合在精子頭前部.經(jīng)DNAⅠ酶消化后的轉(zhuǎn)染率仍然很高,說明經(jīng)液氮冷凍后,外源DNA進入精子內(nèi)部的機率提高.附睪精子與射精的精液經(jīng)洗滌后的精子都能夠吸附6-甲基諾丹明-6-dUTP標(biāo)記DNA.該實驗還對附睪精子和射精精子結(jié)合外源DNA情況的比較,發(fā)現(xiàn)附睪精子與射精的精液經(jīng)洗滌后的精子都能夠吸附外源DNA,且二者的差異不顯著.該實驗還對比了射精精子與附睪精子結(jié)合DNA后

3、作單精注射后胚胎的發(fā)育情況,發(fā)現(xiàn)二者在陽性胚胎率上沒有顯著差別,射精精子與附睪精子的卵裂率分別是21.6﹪和23﹪,差異不顯著(P<0.05),轉(zhuǎn)GFP基因陽性率分別為15.5﹪和16.5﹪,差異不顯著(P<0.05).在單精注射實驗中由于受到諸如卵子外顆粒細胞的去除、機械穿刺、在卵中導(dǎo)入精子培養(yǎng)液、操作液等使卵的成活率大大降低,另外與精子結(jié)合的外源DNA如果大量表達也可能對胚胎造成傷害.由于這些因素使的影響,胚胎成活率降低.實驗中陽性