化學(xué)誘導(dǎo)去核和全細(xì)胞胞質(zhì)注射法生產(chǎn)牛體細(xì)胞克隆胚胎的研究.pdf

1、在體細(xì)胞核移植研究中,受體卵母細(xì)胞去核和克隆胚胎的構(gòu)建是兩個(gè)影響核移植效率的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的去核方法由于其機(jī)械損傷大、耗時(shí)、設(shè)備和技術(shù)要求高、去除的胞質(zhì)量多、去核效率低,所以嚴(yán)重的影響了核移植的整體效率。最近,化學(xué)誘導(dǎo)去核具有成批處理、操作簡(jiǎn)單、物理?yè)p傷小、胞質(zhì)丟失少等特性,因此適合于大規(guī)模的卵母細(xì)胞去核和克隆動(dòng)物的生產(chǎn)；本試驗(yàn)利用Demecolcine(下文簡(jiǎn)稱Deme)進(jìn)行牛MII卵母細(xì)胞誘導(dǎo)去核條件的優(yōu)化和篩選,然后以輸卵管上皮全

2、細(xì)胞為核供體材料,將供體全細(xì)胞胞質(zhì)注射和Deme化學(xué)誘導(dǎo)去核相結(jié)合,初步建立一種簡(jiǎn)化的牛體細(xì)胞核移植方法,探討在大家畜體細(xì)胞核移植中的可行性。最終目的是簡(jiǎn)化體細(xì)胞核移植步驟,提高整體效率。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.脫羧秋水仙素誘導(dǎo)牛MII卵母細(xì)胞去核效果研究
　　 利用不同濃度Deme和不同處理時(shí)間對(duì)牛MII卵母細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)去核結(jié)果表明,在對(duì)照組中,不同處理時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞去核效率無(wú)顯著影響(P>0.05)；在0.4u

3、g/mL處理濃度下,各處理組去核效率均顯著高于0min處理組(P<0.05)；處理30min組與60min、90min處理組間差異顯著(P<0.05),但后兩組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；在0.5ug/mL和0.6ug/mL濃度條件下,0min、30min、60min、90min處理組也獲得相似的結(jié)果,三個(gè)處理組的去核效率都顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而0.4ug/mL處理組與0.6ug/mL處理組之間差異顯著(P<0.05),

4、而0.5ug/mL,處理組與另外兩個(gè)處理組間都無(wú)顯著差異(P>0.05)。低劑量和短時(shí)間處理負(fù)作用小,所以,0.4ug/mL處理60min組的去核率最理想；采用兩種不同的處理方法M1和M2法,去核率分別為84.97％和78.93％。雖然前者高于后者,但是兩者之間無(wú)顯著差異(P>0.05),M2法的優(yōu)勢(shì)是對(duì)卵母細(xì)胞的損傷小,利用率高；利用0.4ug/mL Deme+0.05MSucrose(蔗糖)和0.4ug/mL Deme+5ug/mL

5、 CB(細(xì)胞松弛素B)配伍,誘導(dǎo)處理1h后去核,去核率分別為70.63％、61.80％,實(shí)驗(yàn)組間差異不顯著(P>0.05),但5ug/mL CB組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)；經(jīng)Deme誘導(dǎo)后78個(gè)凸起和細(xì)胞膜相連的卵母細(xì)胞,置于Deme-free培養(yǎng)液后在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)0h、2h、4h、6h和8h,觀察凸起回復(fù)的卵數(shù)分別為0、15、33、52和62(回復(fù)率分別為O％、19.23％、42.30％、66.67％和79.49％)。這意味

6、著誘導(dǎo)后的卵母細(xì)胞應(yīng)該在2h內(nèi)進(jìn)行機(jī)械輔助去核,以防染色質(zhì)回復(fù)。
　　 2.供體輸卵管上皮細(xì)胞分離純化及其相關(guān)特性研究
　　 利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的五步純化法,對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行純化,經(jīng)廣譜角蛋白(PCK)免疫組化鑒定(SABC法),上皮細(xì)胞純度高達(dá)95％以上；通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)特性的觀察和生長(zhǎng)曲線的測(cè)定,細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好,說(shuō)明培養(yǎng)條件合適；第4代上皮細(xì)胞分別添加了0ng/mL(對(duì)照組)、25ng/mL、50ng/mL和75ng/mL的EGF,

7、加入EGF后第5d,對(duì)照組S期細(xì)胞所占的比例為36.70％,G2-M期細(xì)胞為11.50％,而25ng/mL、50ng/mL和75ng/mL實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞分別為30.30％、26.90％和29.40％,G2-M期細(xì)胞所占的比例分別為10.80％、11.90％和10.90％,和對(duì)照組相比,各期細(xì)胞分布發(fā)生明顯變化,S期的比例呈下降趨勢(shì)。從凋亡情況來(lái)看,對(duì)照組高達(dá)3.40％,而50ng/mL組最低,僅為0.86％,這表明50ng/mLEGF有

8、利于上皮的生長(zhǎng)。
　　 3.化學(xué)誘導(dǎo)去核聯(lián)合全細(xì)胞胞質(zhì)注射進(jìn)行牛重構(gòu)胚胎構(gòu)建,比較其發(fā)育情況。
　　 Deme誘導(dǎo)后經(jīng)機(jī)械輔助去核,利用全細(xì)胞胞質(zhì)注射共構(gòu)建重構(gòu)胚胎40枚,卵裂率為62.50％(25/40),囊胚率10.00％(4/40)；誘導(dǎo)后選擇凸起明顯的卵母細(xì)胞,直接進(jìn)行全細(xì)胞胞質(zhì)注射,共構(gòu)建胚胎71枚,卵裂率為52.11％(37/71),囊胚率8.45％(6/71),兩組之間卵裂率和囊胚率均差異不顯著(P>0.0