治療性克隆核供體細(xì)胞選擇的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本課題以端粒酶活性作為篩選指標(biāo)，首先選取治療性克隆中核供體細(xì)胞的主要來源組織——皮膚、肌肉、骨髓，以睪丸組織為參照，同時(shí)觀察了神經(jīng)移植中可能的供體細(xì)胞來源——腦組織。采用PCR-ELISA法檢測不同年齡各Ⅰ組織端粒酶活性表達(dá)情況。比較分析其端粒酶表達(dá)隨年齡變化的規(guī)律；隨后采用密度梯度離心法分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)，給予不同血清濃度的培養(yǎng)體系，觀察細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡的變化，分析細(xì)胞端粒酶活性的改變，并對(duì)細(xì)胞部分表面標(biāo)志進(jìn)行鑒定。初步

2、觀察了BMSCs基本生物學(xué)特性、神經(jīng)分化功能及不同血清濃度對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的影響；最后分離培養(yǎng)不同年齡大鼠成纖維細(xì)胞和BMSCs，觀察不同年齡成纖維細(xì)胞和BMSCs在細(xì)胞生長、端粒長度變化和端粒酶活性表達(dá)的差異，并以成纖維細(xì)胞為對(duì)照，探討骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSSC)作為核供體細(xì)胞用于治療性克隆的可行性和優(yōu)勢。為下一步建立克隆性胚胎干細(xì)胞(ESCs)用于中樞神經(jīng)移植治療奠定基礎(chǔ)。 結(jié)論：本研究結(jié)果不僅證實(shí)分化成熟的組織不具有

3、端粒酶活性，同時(shí)也證Ⅳ實(shí)骨髓組織中含有具有表達(dá)端粒酶活性的細(xì)胞，且這種活性隨年齡的增長基本保持穩(wěn)定。由于骨髓組織具有取材容易，損傷小等優(yōu)點(diǎn)，這種表達(dá)端粒酶活性的細(xì)胞可能是一種較好的治療性克隆核供體細(xì)胞。 BMSCs根據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)的不同可以將分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種細(xì)胞，其中Ⅱ型細(xì)胞不僅具有高活性端粒酶表達(dá)，而且可以分化為Nestin陽性細(xì)胞，是骨髓中保持未分化或低分化狀態(tài)并具有橫向分化能力的干細(xì)胞群，即BMSSC。它是骨髓組織保持穩(wěn)定

4、端粒酶表達(dá)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。FBS對(duì)BMSCs增殖的影響主要表現(xiàn)為對(duì)Ⅰ型細(xì)胞的增殖具有明顯促進(jìn)作用。FBS不能促進(jìn)Ⅱ型細(xì)胞增殖。在短時(shí)間內(nèi)FBS對(duì)Ⅱ型細(xì)胞不具有明顯的促分化作用。 雖然成纖維細(xì)胞是動(dòng)物克隆中最為常用的細(xì)胞種類，也是治療性克隆中最容易獲得的細(xì)胞。但成纖維細(xì)胞隨著年齡的增長，不僅端粒長度不斷縮短，而且細(xì)胞本身增殖能力也明顯下降。在目前低克隆效率的情況下，成纖維細(xì)胞這種隨年齡變化的規(guī)律可能對(duì)克隆的效率和克隆后細(xì)胞的功能產(chǎn)生

5、影響。 BMSSC是目前研究最多的成體干細(xì)胞，具有取材容易、分離方法簡單、損傷小、來源充足等優(yōu)點(diǎn)。本研究BMSCs培養(yǎng)體系中的Ⅱ型細(xì)胞，具有隨年齡變化仍穩(wěn)定表達(dá)的端粒酶活性和分化為Nestin陽性細(xì)胞的橫向分化能力，不僅具有BMSSC的自我復(fù)制和橫向分化能力，而且表達(dá)CD29、CD44，不表達(dá)CD31、CD34和CD45細(xì)胞表面抗原，因此Ⅱ型細(xì)胞就是BMSSC。它不僅具有與Ⅰ型細(xì)胞完全不同的形態(tài)學(xué)變化過程，在培養(yǎng)過程中容易將兩者