手工克隆豬體細(xì)胞核移植胚胎的研究.pdf

1、本研究選擇胎兒成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞，通過化學(xué)輔助手工去核的途徑構(gòu)建豬的核移植重構(gòu)胚。嘗試建立適合本實(shí)驗(yàn)室豬的手工核移植體系，為今后建立高效的手工克隆豬體細(xì)胞核移植研究打下基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下：
　　1.本研究利用豬耳組織塊培養(yǎng)法接種,培養(yǎng)3～4d，可見細(xì)胞沿著組織塊邊緣向外爬出，6d左右即可明顯觀察到細(xì)胞沿著組織塊的周圍長(zhǎng)出，呈典型成纖維狀。用30％FBS+10%DMSO+60%DMEM凍存細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞復(fù)蘇后4～6h可見細(xì)胞

2、貼壁，細(xì)胞存活率達(dá)90%以上。通過消化處理后，可以獲得豬胎兒成纖維細(xì)胞。這樣為以后的核移植研究提供了供核細(xì)胞。
　　2.脫羰秋水仙堿誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞顯核。通過比較在不同的時(shí)間和不同的Deme濃度對(duì)豬卵母細(xì)胞顯核的影響。結(jié)果顯示：①添加不同濃度的DC處理卵母細(xì)胞1 h，各組去核率經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異不顯著，而以0.4μg/mL的濃度組顯核率最高，達(dá)到80.8%，②0.4μg/mL DC誘導(dǎo)豬卵母細(xì)胞顯核，處理30，40,50，60min時(shí)獲

3、得的顯核率較高（75.5%；75.0%；74.5%；72.8%），各組去核率差異不顯著。
　　3.研究了在不同電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖次數(shù)和電場(chǎng)時(shí)程三個(gè)條件下對(duì)豬去核卵母細(xì)胞融合的影響。結(jié)果表明：①在電場(chǎng)時(shí)程30μs，1 DC時(shí)，電場(chǎng)強(qiáng)度0.8kv/cm的條件下卵母細(xì)胞的融合率（94.7%）較其他各組高；當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)繼續(xù)增大時(shí)，融合率下降（88.6%，87.7%，84.3%）。②在電場(chǎng)強(qiáng)度為0.8kv/cm，1次直流脈沖的條件下，脈沖時(shí)程初始為

4、30μs時(shí)，卵母細(xì)胞融合率為94.7%；當(dāng)脈沖時(shí)程達(dá)到60μs和90μs時(shí)，融合率分別是86.5%和83.8%；卵母細(xì)胞的融合率有明顯地下降。③在電場(chǎng)強(qiáng)度為0.8kv/cm，電場(chǎng)時(shí)程為30μs的條件下，1次電脈沖激活卵母細(xì)胞的融合率（94.7%）和2次電脈沖的融合率（95.6%）無(wú)顯著差異（94.7%，95.6%,P﹥0.05），但兩者顯著高于3次電脈沖的融合率（81.7%）。
　　4.通過以傳統(tǒng)和手工兩種方法對(duì)豬卵母細(xì)胞進(jìn)行核移