體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)克隆豬及轉(zhuǎn)基因豬程序的研究.pdf

1、體細(xì)胞核移植技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，體細(xì)胞克隆包括許多環(huán)節(jié)，影響克隆效率的包括很多重要因素，如受體卵母細(xì)胞的去核，以及重構(gòu)胚的表觀遺傳修飾，另外轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為供體細(xì)胞也受到很大的爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)嘗試從對(duì)化學(xué)輔助去核方法（Demecolcine處理）的深入探究，組蛋白去乙?；种苿–UDC-101）對(duì)表觀遺傳的修飾及轉(zhuǎn)基因（IFN-γ，scFv，IS）與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植生產(chǎn)克隆豬及轉(zhuǎn)基因豬三方面著手，進(jìn)一步

2、對(duì)體細(xì)胞核移植生產(chǎn)克隆豬及轉(zhuǎn)基因豬的操作程序進(jìn)行研究。
　　實(shí)驗(yàn)一：Demecolcine（DEM）是一種微管破壞劑，在許多物種中已廣泛應(yīng)用于M II卵母細(xì)胞的去核，然而，目前沒有報(bào)道探究這種方法對(duì)豬卵母細(xì)胞中細(xì)胞成熟促進(jìn)因子（MPF）分布的影響。
　?。?）本實(shí)驗(yàn)探究了不同DEM處理時(shí)間對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟后MPF活性的影響。DEM處理豬卵母細(xì)胞0.5h、1h、2h、3h后MPF活性均高于對(duì)照組，在處理1h后MPF活性達(dá)到最高

3、值，因此確定1h處理時(shí)間為DEME的最佳處理時(shí)間。
　?。?）探究了DEM處理對(duì)豬卵母細(xì)胞去核后MPF及其亞基Cyclin B1的分布影響。我們分析了DEM處理后MPF水平和Cyclin B1在豬卵母細(xì)胞中的分布。我們證明了經(jīng)卵母細(xì)胞處理0.4μg/ml DEM1h影響了MPF的分布，使MPF的分布發(fā)生改變，集中于細(xì)胞質(zhì)中，從而提高去核后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)MPF濃度，極大限度的保留了MⅡ期卵母細(xì)胞MPF活性；免疫熒光染色觀察MPF的調(diào)解亞基

4、Cyclin B1，DEM處理組中紡錘體微管被破壞并誘導(dǎo)染色質(zhì)凝集，Cyclin B1較為均勻的分布于整個(gè)卵母細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致MPF水平升高。
　?。?）比較了化學(xué)輔助去核法和機(jī)械去核法去核效率及細(xì)胞質(zhì)中MPF含量的比較。分別采用化學(xué)輔助去核和機(jī)械去核法去除豬卵母細(xì)胞細(xì)胞核，對(duì)去核前后卵母細(xì)胞MPF水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)化學(xué)輔助去核法對(duì)卵母細(xì)胞MPF水平未有改變，而機(jī)械去核法使MPF水平降低。去核后注入五指山小型豬耳皮細(xì)胞，對(duì)重構(gòu)胚進(jìn)行培

5、養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)化學(xué)輔助去核法的去核率及注核后細(xì)胞的發(fā)育，囊胚率均高于普通機(jī)械去核法，2-4細(xì)胞發(fā)育率分別為80.6％、78.8%，囊胚率分別為16.3%、14.1%，差異并不顯著。體內(nèi)發(fā)育實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證化學(xué)輔助去核法優(yōu)于機(jī)械去核組。這為理解化學(xué)輔助去核方法提供理論根據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)二：體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)的克隆動(dòng)物其成功率低，這與表觀遺傳異常有一定關(guān)聯(lián)，這其中就包括組蛋白乙?；漠惓！Ｍㄟ^組蛋白去乙?；种苿?，可以改變表觀遺傳狀態(tài)，從而進(jìn)一步提

6、高體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育潛能。CUDC-101已經(jīng)有研究證明這種去乙?；种苿┛梢蕴岣呓M蛋白乙?；剑窃隗w細(xì)胞克隆胚胎方面至今還未有人使用。本研究是使用CUDC-101探究其對(duì)豬體細(xì)胞核移植胚胎的影響。利用不同濃度的組蛋白去乙?；种苿?CUDC-101處理豬體細(xì)胞克隆胚胎24 h，尋找最適合濃度，隨后用最適濃度處理不同時(shí)間。確定好最佳時(shí)間和最佳濃度后，將胚胎通過胚胎移植移入代孕母豬體內(nèi)，觀察其妊娠情況。結(jié)果：在體外發(fā)育的胚胎給予不

7、同濃度的CUDC-101處理，觀察各濃度對(duì)于胚胎發(fā)育能力的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)1μM的CUDC-101處理24h的胚胎與對(duì)照組以及0.5，10μM處理組相比，其囊胚率明顯提高，分別為18.1%，9.9%，8.1%和0.0%（P<0.05）。用1μM的CUDC-101處理重構(gòu)胚不同的時(shí)間，并在處理后激活胚胎。結(jié)果可知，經(jīng)24 h處理的胚胎，囊胚率高于其他組別。對(duì)CUDC-101處理的胚胎以及未經(jīng)處理胚胎進(jìn)行胚胎移植，移植到代孕母豬體內(nèi)。綜上

8、所述，CUDC-101均可以顯著提高豬SCNT胚胎體內(nèi)及體外核重編程的發(fā)育能力。
　　實(shí)驗(yàn)三：通過體細(xì)胞克隆方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)成為一種新方法，在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)u(píng)估了通過體細(xì)胞核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的效率，供體細(xì)胞采自2歲雌性五指山小型豬耳皮細(xì)胞，細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染三種不同抗病基因，分別為轉(zhuǎn)染豬γ干擾素（IFN-γ）基因，抗口蹄疫病毒單鏈抗體基因（scFv）、豬IFN-γ及抗口蹄疫病毒scFv融合基因(IS)，與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞比較，作為供體

9、細(xì)胞用于體細(xì)胞克隆。
　　結(jié)果：
　?。?）我們?cè)u(píng)估了當(dāng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分別作為供體時(shí)的胚胎的發(fā)育潛能，在卵裂率無顯著差異，分別為78.4%，79.5%，79.7%和80.6%，在隨后囊胚率上也無顯著差異，分別為10.8%，12.0%，11.4%和16.2%。
　?。?）將轉(zhuǎn)有3種不同基因及非轉(zhuǎn)基因組的重構(gòu)胚分別被移植到27頭代孕母豬體內(nèi)，其中19頭在胚胎移植后24-26天B超檢查中表現(xiàn)為妊娠，最終11頭代孕母

10、豬分娩生產(chǎn)下67頭仔豬，仔豬出生一周后有25頭死亡，最終我們獲得了49頭存活克隆仔豬。經(jīng)比較，轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組在克隆仔豬成活率上并未有顯著性差異，分別為57.1%，52.6%，50.0%和66.6%（P<0.05）。經(jīng)PCR基因分析，6頭表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因陽性。其中，5頭為scFv基因陽性，1頭為IFN-γ基因陽性。結(jié)論， 我們成功生產(chǎn)出轉(zhuǎn)有IFN-γ和scFv基因的克隆五指山小型豬，與非轉(zhuǎn)基因克隆豬相比較，在卵裂率、囊胚率及產(chǎn)