利用體細胞核移植及嵌合體技術制備熒光蛋白轉基因豬的研究.pdf

1、豬在體型大小、消化代謝和基因組等方面都與人的極為相似，是人類疾病模型和異種器官移植研究的理想動物，轉熒光蛋白報告基因的工具豬在異種移植、嵌合體和醫(yī)學領域具有重要的應用價值。本研究利用轉基因技術、體細胞核移植技術和嵌合體技術，進行構建綠色熒光蛋白示蹤的工具豬及嵌合體豬的研究。
　　1、構建α-1，3半乳糖基轉移酶敲除(GTKO)小型豬（巴馬、五指山）原代耳成纖維細胞系，利用脂質(zhì)體或電轉染技術轉染細胞系，G418篩選獲得了可用于后續(xù)試

2、驗的綠色熒光蛋白(EGFP)和橘紅色熒光蛋白(huKO)陽性細胞。
　　2、EGFP陽性克隆點細胞為核供體進行體細胞核移植和胚胎移植，移植559枚胚胎到3頭受體母豬，1頭母豬分娩產(chǎn)出2個EGFP陽性克隆豬。采樣心、肝、脾、肺、腎、胰腺、腸、胃、舌、大腦、小腦、脊髓和骨骼肌肉等13種組織進行石蠟切片觀察、Western和實時定量PCR分析，結果顯示EGFP為全身性表達，但是在肝臟、大腦、小腦和脊髓中的表達較弱。
　　3、顯微注

3、射iPS細胞構建嵌合體胚胎，胚胎移植進行體內(nèi)驗證iPS細胞的全能性。共計移植602枚嵌合胚，獲得9個胎兒（其中1-5#進行PCR檢測）。通過小動物活體和體式熒光觀測未發(fā)現(xiàn)有EGFP表達;PCR檢測顯示1#胎兒頭部和2#胎兒胎盤檢測到EGFP基因。
　　4、通過注射和聚合法進行嵌合體豬的研究，共移植了436枚胚胎;但是未獲得嵌合體胎兒。
　　總之，本研究利用體細胞核移植技術成功獲得了GFP廣泛表達的GTKO豬，建立了制備嵌合體