慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因標(biāo)記與豬嵌合體制作研究.pdf

1、嵌合體是指將兩種或多種具有不同遺傳性狀的胚胎或多能性細(xì)胞和早期胚胎聚合或經(jīng)顯微注射后所發(fā)育產(chǎn)生的一個個體。嵌合體是發(fā)育生物學(xué)研究非常重要的技術(shù)手段，同時嵌合體發(fā)育，尤其是生殖系嵌合已經(jīng)成為多能性干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞)發(fā)育潛能的重要鑒定標(biāo)準(zhǔn)。哺乳動物中小鼠的嵌合體研究是最廣泛的，也是最深入的，但是其他物種方面的研究則相對較少。豬是重要的畜牧生產(chǎn)物種，同時也是重要的人類醫(yī)學(xué)模型，針對豬的多潛能干細(xì)胞研究近些年也得到越來越多的

2、重視。作為檢驗(yàn)干細(xì)胞多能性重要標(biāo)準(zhǔn)之一的嵌合體發(fā)育在豬上也同樣得到了大家的關(guān)注。盡管早期有些關(guān)于豬嵌合體研究的報(bào)道，但是相對來說這些研究還很不系統(tǒng)，對于豬胚胎發(fā)育的特殊規(guī)律重視還不夠。針對這種現(xiàn)狀，本次實(shí)驗(yàn)首先建立了慢病毒載體介導(dǎo)制作綠色熒光蛋白標(biāo)記胚胎的技術(shù)體系，在此基礎(chǔ)上探討了不同發(fā)育階段胚胎之間的嵌合發(fā)育規(guī)律，同時也初步探討了部分豬iPS細(xì)胞系的嵌合發(fā)育能力，希望為今后該類研究能夠提供較為堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如

3、下
　　 1、慢病毒介導(dǎo)的GFP轉(zhuǎn)基因豬胚胎體系研究
　　 (1)同時期胚胎注射不同滴度慢病毒，其中2×109I.U./ml的慢病毒感染豬胚胎組中，體外受精(In Vitro Fertilization，IVF)和孤雌胚胎感染陽性率(80.00％、76.36%)和陽性囊胚率(90.74%、89.56%)都顯著(P<0.05)高于其它組，囊胚期的熒光強(qiáng)度也顯著高于其他組，2×108I.U./ml滴度感染胚胎效率其次，2×1

4、07I.U./ml滴度的慢病毒感染效率最差。
　　 (2)同一滴度慢病毒感染不同時期胚胎，2×109I.U./ml的慢病毒感染豬2-cell胚胎組中，IVF和孤雌胚胎感染陽性率(80.00%、76.36%)和陽性囊胚率(90.74%、89.56%)都顯著(P<0.05)高于2×109I.U./ml的慢病毒感染豬1-cell胚胎組胚胎感染陽性率(60.07.00%、57.51%)和陽性囊胚率(79.17%、75.29%)；囊胚期的

5、熒光強(qiáng)度也顯著高于1-cell組；在2×108I.U./ml的慢病毒注射到兩種胚胎后同樣得到和上述一致的結(jié)果。
　　 (3)當(dāng)慢病毒滴度是2×107I.U./ml或低于2×107I.U./ml時，即便在2-cell時期注射也幾乎無法有效感染豬胚胎。另外，慢病毒感染的兩種胚胎與對照組在卵裂率、囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)三個指標(biāo)上沒有顯著差異(P>0.05)。
　　 2、不同發(fā)育時期胚胎聚合發(fā)育研究
　　 (1)同步發(fā)育胚胎

6、聚合后，在8-細(xì)胞胚胎之間的嵌合率(75.00%)高于4-細(xì)胞胚胎之間和2-細(xì)胞胚胎之間的嵌合率(65.00%、53.80%，P<0.05)
　　 (2)非同步發(fā)育胚胎聚合后，2-細(xì)胞胚胎之間嵌合囊胚率和2-細(xì)胞卵裂球互換嵌合囊胚率(53.85%、62.50%)顯著高于2-細(xì)胞胚胎與4-細(xì)胞胚胎的嵌合率(18.60%，P<0.05)。
　　 3、iPS嵌合胚胎的研究
　　 (1)在2-cell、4-cell和8-

7、cell胚胎期注射具有綠色熒光標(biāo)記的iPS細(xì)胞后培養(yǎng)1-2天后，綠色熒光消失，iPS無法嵌合到胚胎；在囊胚階段注射，在體外培養(yǎng)1-2天后，部分ips細(xì)胞可以貢獻(xiàn)到囊胚，形成嵌合胚胎。
　　 (2)幾種iPS嵌合率的比較，68號、120號和122號iPS細(xì)胞嵌合率沒有明顯差異，實(shí)驗(yàn)組的平均囊胚細(xì)胞數(shù)多于對照組，說明一些iPS細(xì)胞已經(jīng)嵌合到胚胎內(nèi)。
　　 (3)胚胎移植后的結(jié)果分析，共4株iPS細(xì)胞系作為供體細(xì)胞，體內(nèi)和IV

8、F胚胎作為受體，共移植19頭豬，其中68號嵌合胚移植受體后發(fā)生妊娠，但大概40天左右時間流產(chǎn)，胎體被吸收，獲得2個胎盤。
　　 (4)胎盤的鑒定和分析，豬的胎盤為散布狀，組織切片HE染色后觀察到絨毛和絨毛毛細(xì)血管，PCR分析初步鑒定結(jié)果為陽性。
　　 綜上所述，2×109 I.U./ml的慢病毒載體感染2-細(xì)胞期胚胎轉(zhuǎn)基因效率最高，對豬胚胎發(fā)育沒有明顯影響。8-細(xì)胞胚胎間聚合后的嵌合發(fā)育率顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組；同步發(fā)育胚胎