慢病毒載體介導的綠色熒光蛋白轉基因標記與豬嵌合體制作研究.pdf

1、嵌合體是指將兩種或多種具有不同遺傳性狀的胚胎或多能性細胞和早期胚胎聚合或經(jīng)顯微注射后所發(fā)育產(chǎn)生的一個個體。嵌合體是發(fā)育生物學研究非常重要的技術手段，同時嵌合體發(fā)育，尤其是生殖系嵌合已經(jīng)成為多能性干細胞(胚胎干細胞、誘導性多能干細胞)發(fā)育潛能的重要鑒定標準。哺乳動物中小鼠的嵌合體研究是最廣泛的，也是最深入的，但是其他物種方面的研究則相對較少。豬是重要的畜牧生產(chǎn)物種，同時也是重要的人類醫(yī)學模型，針對豬的多潛能干細胞研究近些年也得到越來越多的

2、重視。作為檢驗干細胞多能性重要標準之一的嵌合體發(fā)育在豬上也同樣得到了大家的關注。盡管早期有些關于豬嵌合體研究的報道，但是相對來說這些研究還很不系統(tǒng)，對于豬胚胎發(fā)育的特殊規(guī)律重視還不夠。針對這種現(xiàn)狀，本次實驗首先建立了慢病毒載體介導制作綠色熒光蛋白標記胚胎的技術體系，在此基礎上探討了不同發(fā)育階段胚胎之間的嵌合發(fā)育規(guī)律，同時也初步探討了部分豬iPS細胞系的嵌合發(fā)育能力，希望為今后該類研究能夠提供較為堅實的技術基礎。
　　 實驗結果如

3、下
　　 1、慢病毒介導的GFP轉基因豬胚胎體系研究
　　 (1)同時期胚胎注射不同滴度慢病毒，其中2×109I.U./ml的慢病毒感染豬胚胎組中，體外受精(In Vitro Fertilization，IVF)和孤雌胚胎感染陽性率(80.00％、76.36%)和陽性囊胚率(90.74%、89.56%)都顯著(P<0.05)高于其它組，囊胚期的熒光強度也顯著高于其他組，2×108I.U./ml滴度感染胚胎效率其次，2×1

4、07I.U./ml滴度的慢病毒感染效率最差。
　　 (2)同一滴度慢病毒感染不同時期胚胎，2×109I.U./ml的慢病毒感染豬2-cell胚胎組中，IVF和孤雌胚胎感染陽性率(80.00%、76.36%)和陽性囊胚率(90.74%、89.56%)都顯著(P<0.05)高于2×109I.U./ml的慢病毒感染豬1-cell胚胎組胚胎感染陽性率(60.07.00%、57.51%)和陽性囊胚率(79.17%、75.29%)；囊胚期的

5、熒光強度也顯著高于1-cell組；在2×108I.U./ml的慢病毒注射到兩種胚胎后同樣得到和上述一致的結果。
　　 (3)當慢病毒滴度是2×107I.U./ml或低于2×107I.U./ml時，即便在2-cell時期注射也幾乎無法有效感染豬胚胎。另外，慢病毒感染的兩種胚胎與對照組在卵裂率、囊胚率和囊胚細胞數(shù)三個指標上沒有顯著差異(P>0.05)。
　　 2、不同發(fā)育時期胚胎聚合發(fā)育研究
　　 (1)同步發(fā)育胚胎

6、聚合后，在8-細胞胚胎之間的嵌合率(75.00%)高于4-細胞胚胎之間和2-細胞胚胎之間的嵌合率(65.00%、53.80%，P<0.05)
　　 (2)非同步發(fā)育胚胎聚合后，2-細胞胚胎之間嵌合囊胚率和2-細胞卵裂球互換嵌合囊胚率(53.85%、62.50%)顯著高于2-細胞胚胎與4-細胞胚胎的嵌合率(18.60%，P<0.05)。
　　 3、iPS嵌合胚胎的研究
　　 (1)在2-cell、4-cell和8-

7、cell胚胎期注射具有綠色熒光標記的iPS細胞后培養(yǎng)1-2天后，綠色熒光消失，iPS無法嵌合到胚胎；在囊胚階段注射，在體外培養(yǎng)1-2天后，部分ips細胞可以貢獻到囊胚，形成嵌合胚胎。
　　 (2)幾種iPS嵌合率的比較，68號、120號和122號iPS細胞嵌合率沒有明顯差異，實驗組的平均囊胚細胞數(shù)多于對照組，說明一些iPS細胞已經(jīng)嵌合到胚胎內(nèi)。
　　 (3)胚胎移植后的結果分析，共4株iPS細胞系作為供體細胞，體內(nèi)和IV

8、F胚胎作為受體，共移植19頭豬，其中68號嵌合胚移植受體后發(fā)生妊娠，但大概40天左右時間流產(chǎn)，胎體被吸收，獲得2個胎盤。
　　 (4)胎盤的鑒定和分析，豬的胎盤為散布狀，組織切片HE染色后觀察到絨毛和絨毛毛細血管，PCR分析初步鑒定結果為陽性。
　　 綜上所述，2×109 I.U./ml的慢病毒載體感染2-細胞期胚胎轉基因效率最高，對豬胚胎發(fā)育沒有明顯影響。8-細胞胚胎間聚合后的嵌合發(fā)育率顯著高于其他實驗組；同步發(fā)育胚胎