利用慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因小鼠和生胚胎的研究.pdf

1、慢病毒載體源于HIV-1前病毒(HIV-1 provirus)基因組。其宿主范圍廣,可以感染分裂和非分裂細(xì)胞；整合效率高,并可以使外源基因穩(wěn)定長期地表達(dá)。慢病毒載體已經(jīng)成功地應(yīng)用于多種轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)。本試驗(yàn)使用三質(zhì)粒系統(tǒng)的慢病毒載體,它屬于自我失活性載體,并含有WPRE等調(diào)控元件。
　　 Fat-1基因來源于秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans),其表達(dá)產(chǎn)物為一種ω-3不飽和脂肪酸脫氫酶?？梢詫ⅵ?6多不

2、飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)轉(zhuǎn)化成ω-3PUFAs,提高了動物體內(nèi)ω-3 PUFAs的含量。ω-3 PUFAs對人類的健康有重要作用,可以提高機(jī)體免疫力,預(yù)防多種心血管疾病等。本試驗(yàn)構(gòu)建了由IRES介導(dǎo)的可同時(shí)表達(dá)Fat—1基因和標(biāo)記基因EGFP的慢病毒載體。為后續(xù)轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 以往的慢病毒包裝方法效率較低,且結(jié)果不穩(wěn)定。為提高慢病毒包裝效率,本試驗(yàn)研究比

3、較了貼壁和懸浮293T細(xì)胞的磷酸鈣法慢病毒包裝效果。結(jié)果表明,利用懸浮細(xì)胞獲得的病毒滴度較貼壁細(xì)胞高近3.5倍,同時(shí),轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞的進(jìn)行慢病毒包裝具有很好的重復(fù)性,且懸浮細(xì)胞直接用于病毒包裝,節(jié)省了至少24小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。因此,本試驗(yàn)建立了懸浮細(xì)胞慢病毒高效包裝技術(shù)。
　　 本試驗(yàn)研究了慢病毒與精子共孵育后體外受精制備轉(zhuǎn)基因動物的方法。在小鼠和牛上重復(fù)多次均沒有得到陽性胚胎。為了研究受精過程對慢病毒感染胚胎的影響,本試驗(yàn)采用卵

4、周隙顯微注射的方法,用低滴度的病毒(106 TU/ml)分別感染小鼠受精卵和卵母細(xì)胞。受精卵組的陽性率為8.3％,卵母細(xì)胞組沒有得到陽性胚胎。此結(jié)果表明受精過程并沒有明顯提高慢病毒感染小鼠胚胎的效率。
　　 為了研究慢病毒載體在制備轉(zhuǎn)基因牛上的應(yīng)用,本試驗(yàn)分別取卵母細(xì)胞、受精卵、2～4細(xì)胞胚胎、8～16細(xì)胞胚胎、16細(xì)胞以上的桑葚胚,采用滴度為108 TU/ml的慢病毒進(jìn)行透明帶下顯微注射。結(jié)果:受精卵組和2～4細(xì)胞胚胎組都沒有