慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠制備技術(shù)研究.pdf

1、研究目的及背景： 轉(zhuǎn)基因動物模型是聯(lián)系分子、細(xì)胞水平研究和整體動物研究的橋梁。自1980年Gordon首次采用原核顯微注射開展動物轉(zhuǎn)基因研究以來，已有十多種主要的轉(zhuǎn)基因動物制作方法，如原核顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染法、精子介導(dǎo)法、胚胎干細(xì)胞法，體細(xì)胞核移植法等。這些轉(zhuǎn)基因動物制備方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：原核顯微注射法制作轉(zhuǎn)基因動物DNA整合效率低，整合位點(diǎn)不定，技術(shù)難度大，應(yīng)用于高等哺乳動物時的效率很低；精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)技術(shù)存在隨機(jī)

2、性和不確定性；胚胎干細(xì)胞法制備的轉(zhuǎn)基因首建動物一般是嵌合體，不易實(shí)現(xiàn)外源基因的自然繁殖傳代，且建立干細(xì)胞系的難度較大，應(yīng)用受到限制；體細(xì)胞核移植法操作難度大，且外源基因的表達(dá)與否受整合位點(diǎn)附近基因的影響。 相對而言，慢病毒侵染法在可操作性、胚胎發(fā)育率、移植妊娠率、目的基因整合效率、目的基因表達(dá)率、陽性個體的選育等方面比上述幾種技術(shù)均有顯著的優(yōu)勢。1976年，Jaenish首次用逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retroviruses)感染胚胎制作轉(zhuǎn)

3、基因動物獲得成功。逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進(jìn)入細(xì)胞后，逆轉(zhuǎn)錄成DNA前病毒，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合酶及其特異的末端核苷酸序列，將DNA前病毒整合到染色體上，從而將其攜帶的外源基因也插入到染色體上。慢病毒(lentivirus)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒的亞科，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)gag、pol和env，不同之處在于慢病毒包含4個輔助基因，vif、vpr、nef、vpu和2個調(diào)節(jié)基因tat和rev。其中調(diào)節(jié)基因tat和rev分別編碼兩個反式激活因子Tat蛋

4、白和Rev蛋白，Tat蛋白在慢病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄延伸過程中發(fā)揮重要作用，Rev蛋白則可促使其基因的表達(dá)由早期向晚期轉(zhuǎn)化。HIV-1DNA前病毒的主要結(jié)構(gòu)基因及其排列形式與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒相同，為5’LTR-gag-pro-pol-env-3’LTR，其中g(shù)ag基因編碼病毒的核心蛋白，pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶類，env基因編碼病毒的包膜糖蛋白，pro基因則編碼切割蛋白前體所需的蛋白酶。慢病毒載體(Lentiviralvector，L

5、V)廣泛用于體外細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和基因治療的研究。目前用LV成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有神經(jīng)細(xì)胞、視網(wǎng)膜感光細(xì)胞、肌細(xì)胞，肝細(xì)胞、早期胚胎細(xì)胞等，用LV制作的轉(zhuǎn)基因動物有小鼠、大鼠、豬，牛等。LV的優(yōu)勢在于：1)轉(zhuǎn)染效率高，能夠感染分裂期和靜息期細(xì)胞，能轉(zhuǎn)染多種組織；2)整合到宿主基因組中的目的基因能持久穩(wěn)定的表達(dá)，不易形成嵌合體，一般能自然繁殖傳代：3)LV經(jīng)改構(gòu)后，不在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，也不會導(dǎo)致寄主細(xì)胞的死亡，免疫源性極小，生物安全性高。LV用于轉(zhuǎn)基

6、因動物模型制備也有一定的局限性：1)一是制備難度較大，不易獲得高滴度、高純度的病毒；2)LV在宿主基因組上的整合一般是隨機(jī)的，可能干擾插入位點(diǎn)及其附近基因表達(dá)；3)雖可通過控制病毒的滴度來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)入基因的拷貝數(shù)，但是不容易實(shí)現(xiàn)整合拷貝數(shù)的精確控制；4)攜帶目的基因的容量較小(＜10kb)，當(dāng)需要插入大片段DNA時，會限制制備LV的滴度：5)LV前病毒DNA在宿主基因上是多位點(diǎn)隨機(jī)整合，當(dāng)轉(zhuǎn)基因啟動子的表達(dá)需要多拷貝時應(yīng)選擇原核顯微注射法。

7、 LV技術(shù)與siRNA結(jié)合使用，可以相對容易地在轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞中對特定基因?qū)崿F(xiàn)RNAi效應(yīng)。RNAi效應(yīng)的核心是一段20-25nt的與靶基因mRNA互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)的短RNA，通過它和靶基因mRNA堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯。要實(shí)現(xiàn)表達(dá)如此短的一段siRNA片段，轉(zhuǎn)基因載體的長度可以控制在很合適的范圍內(nèi)(4～5kb)，對插入目的基因容量有限(＜10kb)的LV來說十分理想，因而LV在制備RNA干擾

8、轉(zhuǎn)基因動物模型上的優(yōu)勢更加明顯。 本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒介導(dǎo)高效地研制了eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，建立了慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠制備技術(shù)體系，并利用該技術(shù)制備了樹突狀細(xì)胞(DentrenticCells，DCs)特異性干擾Rab32基因表達(dá)的RNA干擾小鼠模型，進(jìn)一步驗(yàn)證了利用該技術(shù)體系在小鼠樹突狀細(xì)胞實(shí)現(xiàn)對特定基因進(jìn)行抑制的可行性與有效性。 研究內(nèi)容及結(jié)果： 在第一部分，本課題開展了通過慢病毒載體介導(dǎo)、結(jié)合卵周隙顯微注射、以

9、eGFP為報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備方法學(xué)研究，探討了通過卵周隙顯微注射重組慢病毒對胚胎發(fā)育的影響，以及通過此法研制轉(zhuǎn)基因小鼠的效率。結(jié)果：1)建立并優(yōu)化了三質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，獲得了滴度達(dá)到1×109TU/ml以上的注射用重組慢病毒；通過卵周隙顯微注射，胚胎的2-細(xì)胞卵裂率為81.8％(1189/1453)，與無處理組無顯著差異；在2-細(xì)胞期，每一視野下胚胎陽性率＞90％(1178/1189)，說明包裝的病毒成功并高效地轉(zhuǎn)染小鼠胚胎；2

10、)將注射后發(fā)育至2-細(xì)胞的胚胎通過輸卵管壺腹部穿刺移植法移植后，假孕母鼠妊娠率為42.8％(12/28)，很大程度上避免了傘部移植法出血導(dǎo)致的胚胎存活率下降，提高了移植成功率；3)eGFP首建鼠陽性率為60.8％(73/120)、轉(zhuǎn)基因小鼠的總體研制效率(轉(zhuǎn)基因小鼠數(shù)/注射胚胎數(shù))為5.0％(73/1453)，說明卵周隙顯微注射對胚胎2-細(xì)胞卵裂率幾乎無影響，表明慢病毒載體輔以卵周隙顯微注射法制作轉(zhuǎn)基因動物高效可行；4)將eGFP陽性首

11、建小鼠采用近交方法建系，至第6個世代，熒光觀察發(fā)現(xiàn)超排獲得的胚胎全部呈eGFP陽性，且新生鼠陽性率為100％，說明eGFP基因可以通過種系傳代。 在第二部分，采用了基于siRNA(SmallinterferingRNA)的RNA干擾策略、利用第一部分建立的轉(zhuǎn)基因平臺制作轉(zhuǎn)基因小鼠模型。轉(zhuǎn)基因RNA干擾載體FcdGW-Rab32的表達(dá)產(chǎn)物siRNA-Rab32可在小鼠樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DCs)中特異性干擾R

12、ab32基因，報(bào)告基因?yàn)閑GFP。由于DCs中并沒有熒光素酶基因，構(gòu)建了在DCs中特異性干擾熒光素酶基因的載體質(zhì)粒FcdGW-FF3作為對照。結(jié)果：1)FcdGW-Rab32和FcdGW-FF3組的2-細(xì)胞卵裂率分別為79.8％(408/511)、75.8％(317/418)，受體妊娠率分別為35.7％(5/14)、33.3％(4/12)，移植胚胎體內(nèi)存活率分別為2.7％(11/408)、2.8％(9/317)，轉(zhuǎn)基因首建鼠陽性率分別為

13、54.5％(6/11)、66.7％(6/9)，轉(zhuǎn)基因小鼠總體研制效率分別為1.2％(6/511)、1.4％(6/418)，除胚胎體內(nèi)存活率和總體研制效率外，其他數(shù)據(jù)與第一部分的結(jié)果相當(dāng)；2)經(jīng)PCR檢測和耳廓皮膚真皮層DCs熒光觀察結(jié)果表明，F(xiàn)cdGW-Rab32和FcdGW-FF3轉(zhuǎn)基因小鼠已被建立，目的基因已經(jīng)正確整合至轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中，且能通過種系傳代；3)流式細(xì)胞儀檢測BMDC表明，eGFP只在小鼠的DCs內(nèi)特異性表達(dá)，說明我

14、們所采用的CD11c啟動子具備較好的定向表達(dá)能力；4)通過相對熒光定量PCR(FluorenscentQuantitativePCR,FQ-PCR)對DCs的Rab32基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示Rab32基因的表達(dá)下調(diào)78.3％，特異性地實(shí)現(xiàn)了對DCs的Rab32基因產(chǎn)生Geneknock-down的干擾效應(yīng)。 研究結(jié)論： 1.本課題成功建立了以慢病毒介導(dǎo)、結(jié)合卵周隙顯微注射、以eGFP為報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備技術(shù)